Desenvolvimento de duas plataformas biotecnológicas baseadas em Pichia pastoris e Leishmania tarentolae para produção de candidatos vacinais contra os Papilomavírus humano (HPV) e bovino (BPV) - MARIZ, Filipe Colaço (Universidade Federal de Pernambuco, 2018)
Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-26T18:48:58Z No. of bitstreams: 1 TESE Filipe Colaço Mariz.pdf: 10437063 bytes, checksum: 39022646be419996ba34ec6bd45492a1 (MD5) === Made available in DSpace on 2018-04-26T18:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Filipe Colaço Mariz.pdf: 10437063 bytes, checksum: 39022646be419996ba34ec6bd45492a1 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 === CAPES === O Papilomavírus (PV) é um reconhecido agente de lesões hiperproliferativas benignas que, sob determinadas circunstâncias, podem evoluir para lesões cancerosas. Em humanos, o HPV está relacionado ao desenvolvimento do câncer cervical e anogenital, enquanto o BPV é o agente de cânceres em bovinos e equinos. Atualmente, duas vacinas estão licenciadas para profilaxia contra o HPV, as quais se baseiam em partículas semelhantes ao vírus (VLPs, virus-like particles) obtidas a partir da produção da proteína L1 em sistemas de expressão heteróloga. Apesar de comprovadamente eficazes, ambas as vacinas apresentam importantes limitações relacionadas ao baixo espectro de proteção e elevado custo, o que impede sua implementação sobretudo nos países em desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de duas plataformas biotecnológicas para produção de candidatos vacinais contra o HPV e BPV. Uma das plataformas emprega um sistema genético baseado no promotor constitutivo do gene PGK1 da levedura Pichia pastoris para expressão intracelular da proteína L1 de HPV16. Em paralelo, diferentes candidatos vacinais do HPV e BPV foram desenvolvidos para expressão em Leishmania tarentolae através do emprego de distintos sistemas genéticos. As análises de expressão por dot blotting e western blotting com anticorpos monoclonais demonstram a presença dos candidatos vacinais no lisado das leveduras recombinantes, enquanto evidências obtidas por microscopia eletrônica de transmissão sugerem a formação de VLPs no citoplasma dos clones cultivados. Em contrapartida, as análises por ultracentrifugação e purificação com resina de heparina-sepharose evidenciaram a formação de capsômeros e VLPs quiméricas a partir dos candidatos vacinais produzidos em L. tarentolae. Interessantemente, nossos ensaios apresentam evidências de uma modificação pós-traducional ainda não revelada em espécies de Leishmania, denominada SUMOilação. Demonstramos por diferentes abordagens que tal modificação, ao ser realizada na proteína L2, ocorre através de um padrão semelhante ao descrito em células de mamíferos. Futuros ensaios focarão na determinação dos níveis de produção a partir de cultivos em biorreator e na imunogenicidade de candidatos vacinais desenvolvidos. Esses resultados demonstram a viabilidade do emprego de P. pastoris e L. tarentolae como plataforma vacinal para o desenvolvimento de abordagens potencialmente mais econômicas e de largo espectro contra a papilomatose humana e animal. === Infection by Papillomavirus (PV) is a well-known cause for the establishment of hyperproliferative and benign lesions (warts) that can evolve to carcinoma under specific circumstances. In human, HPV is related to cervical and other anogenital cancer, while BPV is the causal agent of different types of cancer in cattle. The current HPV vaccines licensed for prophylaxis against cervical cancer are based on virus-like particles (VLPs) obtained through the expression of major capsid L1 protein in heterologous expression systems. Although highly effective, both vaccines present important limitations related to their low spectrum of protection and high cost, which compromises their implementation worldwide, mainly in developing countries. Herein, we present the development of two biotechnologic platforms for production of vaccine candidates against HPV and BPV. The first one employs a genetic system based on the Pichia pastoris PGK1 constitutive promoter for intracellular expression of HPV16 L1 protein. In parallel, we designed different HPV16 and BPV1 vaccine candidates for expression in the protozoan Leishmania tarentolae through distinct genetic systems. Expression analysis by dot blotting and western blotting using monoclonal antibodies demonstrated the detection of L1 protein in the total protein lysate of recombinant yeasts, in addition to the electron microscopy evidences suggesting VLP assembling within the cytosol of the clones. In the other hand, ultracentrifugation and purification on heparin-sepharose resin evidenced the assembling of capsomeres and VLP by expressing of L1-based candidates in L. tarentolae. Interestingly, our set of data indicates the occurrence of a post-translational modification by small ubiquitine-like modifier (SUMO) still not revealed in Leishmania species. For the first time, we demonstrate that such modification (SUMOylation), when presented in the L. tarentolae-expressed HPV16 L2 protein, takes place in a mammalian-like pattern. Future studies will focus on immunogenicity assays with the vaccine candidates developed here. The data presented here demonstrated the feasibility of P. pastoris PGK1-based system and L. tarentolae as platforms for the developing of low cost and large spectrum vaccine strategies against human and animal papillomatosis.