Análise da participação de dois homólogos do fator elF4G na iniciação da síntese protéica de Trypanosoma brucei - Maria Nascimento Moura, Danielle (Universidade Federal de Pernambuco, 2014)
Made available in DSpace on 2014-06-12T18:03:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9598_1.pdf: 7683157 bytes, checksum: 0a5c0a98daf12b68a6ab6903f4d4966b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Os tripanossomatídeos são protozoários parasitas que incluem patógenos humanos dos gêneros Trypanosoma e Leishmania e que apresentam como característica marcante a presença de mecanismos moleculares diferenciados, como a regulação da expressão gênica basicamente pós-transcricional. Nestes organismos a tradução pode desempenhar um papel importante para esta regulação, principalmente durante a etapa de iniciação, quando ocorrem interações controladas por fatores protéicos que permitem o recrutamento do ribossomo para a ligação aos mRNAs a serem traduzidos. De fato, indícios obtidos até o momento sugerem que a iniciação da síntese proteica nestes parasitas pode incluir processos diferenciados daqueles observados em outros organismos. Nos eucariotos em geral, o complexo de iniciação da tradução eIF4F desempenha várias funções relacionadas ao recrutamento do ribossomo ao mRNA e é formado por um componente central o fator eIF4G, além de seus parceiros eIF4E e eIF4A. Em L. major, cinco homólogos do fator eIF4G foram identificados (LmEIF4G1- 5), todos conservados em T. brucei (TbEIF4G1-5). Em trabalhos anteriores, dois destes homólogos (LmEIF4G3 e LmEIF4G4) apresentaram propriedades compatíveis com uma atuação na tradução. Neste trabalho, seus ortólogos de T. brucei, TbEIF4G3 e TbEIF4G4, foram selecionados com o intuito de continuar a sua caracterização funcional utilizando agora técnicas in vivo. Em um primeiro momento, reações de imunofluorescência confirmaram a localização citoplasmática das duas proteínas. Em seguida, em ensaios de depleção por RNAi, ambas se mostraram essenciais à viabilidade do parasita, embora apenas no caso do TbEIF4G3 tenha se observado uma diminuição significativa da tradução imediatamente após sua depleção. Ensaios de imunoprecipitação confirmaram interações específicas com homólogos do eIF4E (TbEIF4G3 com TbEIF4E4 e TbEIF4G4 com TbEIF4E3) e ainda a interação entre TbEIF4G3 e um homólogo da proteína de ligação à cauda poli-A (TbPABP1). Para ambos os homólogos, células procíclicas expressando proteínas com mutações em motivos putativos de ligação ao eIF4E apresentaram pequena redução no crescimento. Já em relação ao motivo de ligação ao eIF4A, modificações em sua sequência no TbEIF4G3 levaram a uma forte redução no crescimento de células em cultura, mas nenhum efeito foi observado em mutações equivalentes no TbEIF4G4. Para investigar mais diretamente o papel destas proteínas na tradução, ensaios com mRNAsrepórteres foram desenvolvidos, mas os dados preliminares não se mostraram úteis na identificação da função individual das proteínas avaliadas. Entretanto, vários vetores de transfecção e uma nova linhagem celular com expressão constitutiva da enzimarepórter luciferase foram obtidos e poderão ser usados na otimização dos ensaios e investigação da atuação dos homólogos selecionados em trabalhos futuros. Em resumo, os resultados confirmam a existência de dois complexos eIF4F distintos, mediados por motivos de interação eIF4G/eIF4E diferenciados, e ressaltam o papel crítico do TbEIF4G3 na manutenção da viabilidade e da síntese proteica em T. brucei