Estrutura, expressão e análise funcional do gene codificando Calmodulina no fungo aquático Blastocladiella emersonii

• Main Author: Simão, Rita de Cássia Garcia
• Other Authors: Gomes, Suely Lopes
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2000
• Subjects: Biologia molecular; Blastocladiella emersonii; Expressão gênica; Gene expression; Molecular biology
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-05072019-182508/

O único gene para Calmodulina (CaM) e o cDNA correspondente do quitridiomiceto Blastocladiella emersonii foram isolados e caracterizados. O gene CaM é interrompido por três introns e transcrito como uma única espécie de mRNA de 0,7 kb, codificando uma proteína 91% idêntica à CaM humana. A Calmodulina de B. emersonii foi expressa em Escherichia coli como uma proteína de fusão com Glutationa-S-transferase (GST), purificada por cromatografia de afinidade e clivada da porção GST usando uma protease sítio específico. Na presença de Ca2+, a CaM de B. emersonii exibiu uma alteração na mobilidade eletroforética semelhante à CaM bovina e foi capaz de ativar a autofosforilação da proteína quinase dependente de Ca+2-CaM (CaMKII) de cérebro de rato. A expressão da Calmodulina é regulada durante o desenvolvimento em B. emersonii, o mRNA da CaM e a concentração da proteína aumentam durante a esporulação atingindo um nível máximo antes da liberação dos zoósporos no meio, no final deste estágio. Os níveis da proteína e do mRNA decrescem drasticamente no estágio de zoósporo aumentando novamente durante a germinação. Os antagonistas de CaM, composto 48/80, calmidazolium e W7 inibiram completamente a esporulação de B. emersonii quando adicionados às culturas pelo menos 120, 150 e 180 min após a indução, respectivamente. Todas estas drogas também inibiram o crescimento e a produção de zoósporos neste fungo. O bloqueador de canais de Ca+2 , TMB-8, e o inibidor de CaMKII KN93 inibiram completamente a esporulação quando adicionados até 60 minutos após a indução deste estágio, porém apenas KN93 afetou o crescimento do fungo. Os dados apresentados sugerem que o complexo Ca+2-CaM e a CaMKII têm um papel importante durante o crescimento e esporulação em B. emersonii. === The single Calmodulin (CaM) gene and the corresponding cDNA of the chytridiomycete Blastocladiella emersonii were isolated and characterized. The CaM gene is interrupted by three introns and transcribed in a single 0,7 kb mRNA species, encoding a predicted protein 91% identical to the human CaM. B. emersonii CaM has been expressed in Escherichia coli as a fusion protein with Gluthatione-S-transferase (GST), and purified by affinity chromatography and cleavage from the GST portion using a site-specific protease. In the presence of Ca2+, B. emersonii CaM exhibited a shift in apparent Mr similar to that observed with bovine CaM and was able to activate the autophosphorylation of CaM-dependent protein kinase II (CaMKII) from rat brain. CaM expression is developmentally regulated in B. emersonii, CaM mRNA and protein concentrations increasing during sporulation with maximum levels observed prior to the release of the zoospores to the medium at the end of this stage. Both CaM protein and mRNA levels decrease drastically at the zoospore stage, increasing again during germination. The CaM antagonists, compound 48/80, calmidazolium, and W7 were shown to completely inhibit B. emersonii sporulation when added to the cultures at least 120, 150 and 180 min after induction, respectively. All these drugs also inhibited growth and zoospore production in this fungus. The Ca2+ channel blocker TMB-8 and the CaMKII inhibitor KN93 completely inhibited sporulation if added up to 60 min after induction of this stage, but only KN93 affected fungal growth. The data presented suggest that Ca2+-CaM complex and CaMKII play an important role during growth and sporulation in B. emersonii.