Desenvolvimento e aplicação de RT-PCR em tempo real para Vesiculovirus brasileiros

• Main Author: Tolardo, Aline Lavado
• Other Authors: Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2015
• Subjects: Real time; RT-PCR; Tempo real; Vesiculovirus
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-21102015-110512/

Os Vesiculovirus são um gênero de vírus de RNA da família Rhabdoviridae que inclui os sorotipos Carajás, Cocal, Marabá, Piry, Alagoas e Indiana. Estes são causadores de estomatite vesicular em ruminantes e doença febril humana no Brasil. As vesiculoviroses e suas epidemiologias são pouco conhecidas em seres humanos. Ainda, os Vesiculovirus (VSV) são pouco diagnosticados no homem e em animais pela escassez de métodos laboratoriais diagnósticos. Por isso, objetivamos neste trabalho desenvolver e testar uma RT-PCR em tempo real, pelo método SYBR Green, visando à detecção de VSV brasileiros. Primers que amplificam parte do gene da proteína G dos VSV foram utilizados no teste o qual mostrou-se capaz de detectar genomas dos VSV Piry, Indiana, Alagoas e Carajás. O método foi usado para testar amostras séricas de pacientes com doença febril aguda, de bovinos, de equinos e de macerados de artrópodos. A RT-PCR em tempo real mostrou-se 100 vezes mais sensível que a RT-PCR convencional para Vesiculovirus e também, permitiu detectar até 10 cópias de RNA do vírus Piry. Ainda, a RT-PCR em tempo real para Vesiculovirus mostrou-se capaz de diagnosticar e quantificar o VSV Alagoas nas amostras séricas de bovinos e de equinos. Portanto, a RT-PCR em tempo real desenvolvida neste trabalho, provavelmente, será muito útil no diagnóstico e também, em futuras pesquisas, que permitirão ampliar o conhecimento epidemiológico, ainda pouco conhecido, sobre os Vesiculovirus. === The Vesiculovirus is a Rhabdoviridae family genre of RNA virus that includes serotypes Carajás, Cocal, Maraba, Piry, Alagoas and Indiana. These are causes of vesicular stomatitis in ruminants and human febrile illness in Brazil. The vesiculoviroses and its epidemiology are little known in humans. Still, Vesiculovirus (VSV) are poorly diagnosed in humans and laboratory animals by the lack of diagnostic methods. Therefore, we proposed in this work to develop and test a real-time RT-PCR by SYBR Green method, focusing on the detection of Brazilian VSV. Primers that amplify part of the VSV G protein gene were used in the test which proved capable of detecting genomes of VSV Piry, Indiana, Alagoas and Carajás. The method was used to test serum samples from patients with acute febrile disease, cattle, horses and macerated arthropods. Real time RT-PCR showed to be 100 times more sensitive than conventional RT-PCR for Vesiculovirus and also was possible to detect up to 10 RNA copies of the Piry virus. Also, the real-time RT-PCR for Vesiculovirus proved able to diagnose and quantify Alagoas VSV in serum samples from cattle and horses. Therefore, the real-time RT-PCR developed in this work will probably be very useful in the diagnosis and in future research, which will increase the epidemiological knowledge, as it is still little known about the Vesiculovirus.