Caractérisation fonctionnelle de nouveaux agents chimioattractants de récepteurs orphelins exprimés par les leucocytes

• Main Author: Guillabert, Aude
• Other Authors: Communi David
• Format: Others
• Language: fr
• Published: Universite Libre de Bruxelles 2008
• Subjects: GPCR; chimiotactisme; leucocytes
• Online Access: http://theses.ulb.ac.be/ETD-db/collection/available/ULBetd-02162009-111244/

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) représentent une famille génique parmi les plus nombreuses du génome humain avec plus de 1000 représentants identifiés. Ils ont été classés en sous-familles en fonction de leurs homologies de séquence, la structure de leurs ligands et leur rôle physiologique. Ils régulent un très grand nombre de fonctions physiologiques comme la tension artérielle, le métabolisme, la plupart des actions hormonales et de très nombreuses fonctions cérébrales, et constituent de ce fait des cibles privilégiées pour les agents thérapeutiques. Récemment, deux nouveaux ligands de GPCRs ont pu être identifiés au laboratoire. La chémérine, ligand de haute affinité pour le récepteur ChemR23 et F2L, identifié comme le ligand endogène de FPRL2. Suite à leur identification respective, différents projets ont été initiés afin d’avancer dans la compréhension de leur rôle physiologique. C’est dans cette optique que mon travail de thèse a pu commencer. Dans un premier temps, nous nous sommes attachés à déterminer, parmi les récepteurs FPRs murins, quel récepteur pouvait répondre à F2L, et par extrapolation, être considéré comme l’orthologue murin de FPRL2, l’étude d’homologie de séquence n’ayant pas permis de déterminer un candidat clair entre les deux espèces. Nous avons tout d’abord réalisé un criblage fonctionnel (test de libération de calcium intracellulaire et d’inhibition de AMPc) afin d’identifier, parmi les huit récepteurs cibles, le récepteur répondant à F2L. Fpr2 s’est avéré être le seul candidat répondant à F2L. Nous avons ensuite étudié l’activité fonctionnelle de F2L sur des cellules immunes exprimant Fpr2 (les neutrophiles, les DCs et les macrophages) et enfin nous avons pu effectuer un test de chimiotactisme in vivo prouvant que F2L pouvait recruter ces différents types cellulaires. A l’aide d’une collaboration, nous avons pu également établir que cette activité de F2L sur les neutrophiles ne pouvait être induite que par Fpr2 au vu des résultats négatifs obtenus sur des neutrophiles issus de souris invalidées du gène codant pour Fpr2. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris de comprendre le mécanisme de régulation protéolytique de la chémérine, ligand de ChemR23. Sécrétée en tant que précurseur inactif, la prochémérine nécessite le clivage protéolytique de ces 6 ou 7 acides aminés carboxy-terminaux pour devenir le ligand affin de ChemR23, la chémérine. Dans une précédente étude, nous avions identifié la cathepsine G et l’élastase comme responsable de ce clivage protéolytique, respectivement la chémérine-156 et la chémérine-157. Suite à cette identification, nous sommes attachés à identifier les protéases extracellulaires responsables de la génération des formes de chémérine-155 et chémérine-154, préexistant in vivo et ne présentant pas d’activité fonctionnelle sur le récepteur ChemR23. Ainsi, nous avons démontré que la protéinase 3, conjointement présente dans les granules azurophiles des neutrophiles avec l’élastase et la cathepsine G, clive la prochémérine en un variant inactif, spécifiquement la chémérine-155, comme nous l’avons montré en spectrométrie de masse. Enfin, contrairement aux autres protéases, nous avons identifié la chymase comme la protéase permettant de réguler la chémérine bioactive, en générant à partir de cette dernière un autre variant inactif, la chémérine-154. A côté des récepteurs caractérisés fonctionnellement, existent également des récepteurs dits « orphelins », dont les ligands et la fonction sont inconnus à ce jour. La caractérisation de ces récepteurs représente un enjeu important puisqu’elle devrait permettre l’identification de nouveaux systèmes de communication intracellulaire constituant des cibles potentielles pour le développement d’agents thérapeutiques. Nous nous sommes également attachés à identifier de potentielles activités biologiques liées à la présence d’un ligand endogène de GPCRs orphelins testés. Pour ce faire, nous avons réalisé deux études indépendantes mais complémentaires dans ce but. La première a consisté en la détermination de l’expression génomique de divers GPCRs sur des populations leucocytaires purifiées à partir de sang. Via l’approche de q-PCR à haut débit, nous avons pu obtenir une liste de GPCRs orphelins montrant une expression d’intérêt sur une ou plusieurs populations leucocytaires. Enfin, en parallèle, différentes stratégies de criblage par chromatographie ont été développées afin de permettre la rétention et la séparation d’un grand nombre de molécules diverses et variées pouvant potentiellement activées un GPCR orphelin testé. Ce travail n’a pas encore permis de mettre à jour de nouvelles activités fonctionnelles, mais restent l’objectif majeur de notre étude.