Caracterização de transcritos de ancilostomídeos envolvidos no parasitismo

• Main Author: Ana Flavia Dias Vieira da Costa
• Other Authors: Elida Mara Leite Rabelo
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2012
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-94MKET

=== This study evaluated the transcription profile and differentiaL expression of two classes of genes involved in parasitism by hookworms: asps and Kunitz protease inhibitors. These two classes of genes have been previously identified by presenting a higher level of transcription in males of A. braziliense. The differential transcription was assessed by RT-PCR and qRT-PCR, for asps 4, 5 and 6 of A. braziliense and A. caninun, asps 4 and 5 of A. ceylanicum and two Kunitz proteinase inhibitors genes for the three species. In all species analyzed these genes presented as transcriptionally enriched in male worms. To analyze the different species, new genes were sequenced having been produced seven new partial sequences of asps and Kunitz protease inhibitors genes for the three Ancylostoma species. Since there were no available sequences of these genes for adults N. americanus in the database, 94 consensus sequences were generated "in silico" from the EST database, based on similarity with the orthologous proteins already described for A. ceylanicum and A. caninum. KU domain sequences originating of four different species of hookworms were expressed and used for antibody production. These antibodies were used to compare the differential expression of Kunitz protease inhibitors present in ES products and in total protein extracts between males and females of all four species, by western blot. It was observed a differential expression to some proteins between males and females of A. braziliense A. caninum, A. ceylanicum and N. americanus, and 14 distinct proteins containing the conserved domain have been recognized, some as specific to ES products of N. americanus. The characterization of these proteins can be addressed in future studies. Furthermore, it was shown that recombinant domains KU did not provide protection in hamsters against infection by A. ceylanicum. However, in view of the potential antigenic profile presented by the domains, it opens the prospect that they can be used in combination with other peptides for vaccination trials. Finally, KU recombinants domains were used to assess the immunogenic potential of proteins produced by hookworms possessing such domains, by ELISA using sera from hamsters and dogs infected or not by hookworms. Only sera from dogs infected with A. caninum was able to recognize the recombinant KU domains. === Neste trabalho foi avaliado o perfil de transcrição e expressão diferencial de duas classes de genes envolvidos no parasitismo por ancilostomídeos: asps e inibidores de proteases tipo Kunitz, previamente identificados como sendo mais transcritos em machos de A. braziliense. A transcrição diferencial foi avaliada através da RT-PCR e RT-PCR em tempo real, para as asps 4, 5 e 6 de A. braziliense e A.caninum, asps 4 e 5 de A. ceylanicum e dois genes de inibidores de proteases tipo Kunitz para as três espécies. Em todas as espécies os genes em análise se mostraram com transcrição enriquecida nos vermes machos. Para a análise nas diferentes espécies, novos genes foram sequenciados tendo sido produzidas sete novas sequências parciais de asps e genes de inibidores de proteases tipo Kunitz para as três espécies de Ancylostoma. Como não havia sequências destes genes para adultos de N. americanus disponíveis no banco de dados, foram geradas in silico 94 sequências consenso, a partir do banco de ESTs, baseadas na similaridade com estas proteínas já descritas para A. caninum e A. ceylanicum. Domínios KU originários de sequências das quatro diferentes espécies de ancilostomídeos foram expressos e usados para a produção de anticorpos. Estes anticorpos foram utilizados para comparação da expressão diferencial de inibidores de proteases tipo Kunitz presentes nos produtos ES e extratos protéicos totais entre machos e fêmeas das quatro espécies, por western blot. Foi observada a expressão diferencial de algumas destas proteínas entre machos e fêmeas de A. braziliense, A. caninum, A. ceylanicum e N. americanus, sendo reconhecidas 14 proteínas distintas que contêm o domínio conservado, algumas específicas dos produtos ES de N. americanus que poderão ser alvos de estudos futuros. Além disso, foi demonstrado que os domínios KU recombinantes não conferiram proteção em hamsters contra a infecção por A. ceylanicum. Entretanto, tendo em vista o potencial antigênico apresentado pelos domínios abre-se a perspectiva de que estes possam ser usados em associação com outros peptídeos para ensaios de vacinação. Por fim, os domínios KU recombinantes foram utilizados para avaliar o potencial imunogênico das proteínas produzidas por ancilostomídeos que possuem tais domínios, através de ELISA, utilizando soros de hamsters e cães infectados ou não por ancilostomídeos. Apenas o soro de cães infectados com A. caninum foi capaz de reconhecer os domínios KU recombinantes.