Summary: | === RNA interference (RNAi) represents the only reverse genetic method currently available for manipulating gene-specific expression in Schistosoma spp., since knockout and super-expression induction are not feasible in this parasite. Lately, RNAi has been widely used for gene silencing, but its application as a functional genomic profiling tool in helmints has yet to be explored. In the present study 33 genes, including transcription factors, cell signaling molecules, metabolic enzymes and antioxidants, were selected to determine if gene knockdown by RNAi was associated with morphologically definable phenotypic changes in early intramolluscan larval development. Transcript selection was based on their high expression in in vitro cultured S. mansoni primary sporocysts and/or their potential involvement in developmental processes, such as the anti-oxidants enzymes which are produced by the parasite Schistosoma mansoni and are believed to be involved in the maintenance of cellular redox balance, thus contributing to larval survival in their intermediate snail host, Biomphalaria glabrata. At the present study, miracidia were allowed to transform to sporocysts in the presence of synthesized double-stranded RNAs (dsRNAs) and cultivated for 7 days, during which time developing larvae were closely observed for phenotypic changes including failure/delay in transformation, loss of motility, altered growth and death. Of the phenotypes evaluated, only one was consistently detected; namely a reduction in sporocyst size based on length measurements. The size-reducing phenotype was observed in 11 of the 34 dsRNA treatment groups, and of these, 11 phenotype-associated genes (SOD, Smad1, RHO2, Smad2, Cav2A, ring box, GST26, calcineurin B, Smad4, lactate dehydrogenase and EF1). Após sete dias de incubação com dsRNA, apenas 6 tratamentos demonstraram consistente e significante diminuição nos níveis de transcritos medidos por qRT-PCR. After seven days of incubation, only 6 treatments demonstrated a significant and consistent knockdown of specific transcript expression was detected by q-PCR. Unexpectedly one phenotype-linked gene, SOD, was highly induced (~1600-fold) upon dsRNA exposure. Variation in dsRNA-mediated silencing effects also was evident in the group of sporocysts that lacked any definable phenotype. Out of 23 nonphenotype-expressing dsRNA treatments, 14 were assessed for the transcript levels. Of those, 7 genes exhibited consistent reductions in steady-state transcript levels, while expression level for the rest remained unchanged. Results demonstrate that the efficacy of dsRNA-treatment in producing phenotypic changes and/or altered gene expression levels in S. mansoni sporocysts is highly dependent on the selected gene (or the specific dsRNA sequence used) and the timing after treatment. Aditionally, we have focused on the functional characterization of specific anti-oxidant enzymes, including GST26, GST28, GPx, TPx1/2 and SOD, known to be involved in cellular redox reactions, in an attempt to evaluate their endogenous anti-oxidant function in the early-developing primary sporocyst stage of S. mansoni. Further, we show that treatment of sporocysts with dsRNA of EF1, GST26 or TPx1/2, resulted in a significant decrease (80%, 90% and 50%, respectively) using Western blot analysis compared to dsRNA-GFP control treatment. These results were further confirmed by immunocytochemistry. Experiments were then conducted to determine if anti-oxidant RNAi-induced protein knockdown had a modulating effect on in vitro parasite survival in presence of a sublethal concentration of H2O2. Results clearly demonstrated a significantly higher susceptibility of GST26, GST28, TPx1/2 and GPx dsRNA-treated larvae to H2O2 oxidative stress (60-80% mortalities at 48 hr) compared to GFP dsRNA controls (~15 % mortality). Co-culture of hemocytes and sporocyts allowed evaluating the hypothesis that reducing the antioxidant ability of sporocysts during hemocyte encapsulation reactions would increase their vulnerability to sublethal levels of ROS normally produced by susceptible snail hemocytes. Hence, we demonstrate that GST26, GST28 and TPx1/2-modified sporocysts survival was affected after 24 hours of co-culture, showing the significant protective role of TPxs and GSTs in sporocysts during susceptible intermediate host B. glabrata interaction Although RNAi holds great promise as a functional genomics tool for larval schistosomes, our finding of variable efficiencies in specific gene knockdown indicate a critical need for gene-specific testing and optimization as an essential part of experimental design, execution, and data interpretation. Moreover, anti-oxidant functional experiments strongly support the hypothesis that endogenous expression and regulation of larval anti-oxidant enzymes serve a direct role in protection against external oxidative stress, including immune-mediated cytotoxic reactions. === Atualmente, interferência por RNA (RNAi) é a única metodologia de genética reversa disponível em Schistosoma sp., pois as técnicas de nocaute e super-expressão gênica ainda não são possíveis de serem realizadas nesse parasita. Apesar do silenciamento gênico por RNAi estar sendo mais comumente utilizado, existe muito que se aprimorar para sua aplicação em larga escala em parasitas helmintos. No presente estudo, 33 genes foram selecionados para silenciamento, incluindo fatores de transcrição, moléculas de sinalização, enzimas metabólicas e anti-oxidantes. Estes alvos foram escolhidos, em sua maioria, devido a sua alta expressão na fase larval do parasita, e/ou pelo seu possível envolvimento no processo de desenvolvimento do organismo, como é o caso das enzimas anti-oxidantes, que parecem estar envolvidas na manutenção do equilíbrio redox celular em Schistosoma mansoni, contribuindo para a sobrevivência do parasita no hospedeiro intermediário Biomphalaria glabrata. Neste estudo miracídios de S. mansoni foram transformados in vitro e expostos a dsRNAs dos genes alvos por sete dias, durante os quais, mudanças no fenótipo foram observadas, dentre estas: (1) falha ou atraso na transformação, (2) perda de mobilidade, (3) alteração de tamanho e (4) viabilidade. Dentre os fenótipos avaliados, apenas redução de tamanho dos indivíduos foi consistentemente detectado e observado em 11 de 34 tratamentos com dsRNA dos genes SOD, Smad1, RHO2, Smad2, Cav2A, ring box, GST26, calcineurina B, Smad4, lactato desidrogenase e EF1. Após sete dias de incubação com dsRNA, apenas 6 tratamentos demonstraram consistente e significante diminuição nos níveis de transcritos medidos por qRT-PCR. Inesperadamente, a expressão de um dos genes cujos parasitas exibiram um fenótipo tratamento-associado, o gene SOD, foi altamente induzida (~1600 vezes). Variações no nível dos transcritos em conseqüência do tratamento com dsRNA, também foi evidente em grupos de esporocistos sem fenótipo aparente. Níveis de transcritos de 14 dos 23 grupos tratados com dsRNAs (que não apresentaram fenótipo aparente) foram analisados e, destes, 7 genes exibiram consistente redução no nível de expressão. Resultados demonstraram que a eficácia da utilização da técnica de RNAi é altamente dependente do alvo a ser silenciado, da sequência de dsRNA utilizada e do momento da análise. Adicionalmente, na tentativa de avaliar a função anti-oxidativa endógena de esporocistos de S. mansoni, foi feita a caracterização funcional de algumas enzimas anti-oxidantes do parasita (GST26, GST28, GPx, TPx1/2 e SOD). Foi mostrado através de Western blot que tratamentos com dsRNA para EF1, GST26 ou TPx1/2 resultaram em significativa diminuição dos níveis proteicos (80%, 90% e 50%, respectivamente), dados corroborados por experimentos de imunolocalização. Experimentos in vitro foram conduzidos para determinar o efeito na sobrevivência dos parasitas silenciados para as enzimas anti-oxidantes na presença de concentrações subletais de H2O2. Maior susceptibilidade (60-80% de mortalidade após 48 h) ao estresse oxidativo pode ser claramente observado para parasitas silenciados para GST26, GST28, TPx1/2 e GPx, comparado ao controle GFP (~15 % mortalidade). Co-culturas dos parasitos silenciados para as enzimas anti-oxidantes com hemócitos de B. glabrata susceptível à infecção pelo S. mansoni permitiram avaliar a hipótese de que a redução da habilidade anti-oxidante dos esporocistos aumentaria a sua vulnerabilidade aos níveis sub-letais de ROS normalmente produzidos pelos hemócitos durante o processo de encapsulação. Assim, foi demonstrado que a sobrevivência de esporocistos silenciados para GST26, GST28 e TPx1/2 foi afetada após 24 horas de co-cultura, mostrando um papel significativo de TPxs e GSTs de proteção para sobrevivência do parasita no seu hospedeiro intermediário. Apesar de RNAi prometer grandes avanços como ferramenta de genômica funcional em estágios larvais de esquistossomas, observamos que tratamentos com dsRNA podem gerar eficiências de silenciamento variáveis, indicando uma necessidade de padronização da técnica de forma gene-específica, como parte essencial do desenho experimental. Adicionalmente, experimentos funcionais com enzimas anti-oxidantes suportam fortemente a hipótese de que a regulação desta classe de enzimas em esporocistos tem uma função direta na proteção contra o estresse oxidativo e contra o ataque citotóxico das células de defesa do hospedeiro.
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