Produção, caracterização funcional e imunogênica de uma proteína dermonecrótica recombinante 9recLiD1) da aranha Loxosceles intermédia

• Main Author: Liza Figueiredo Felicori Vilela
• Other Authors: Carlos Delfin Chavez Olortegui
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2008
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-8HCKJN

=== In the present study the recombinant form (rLiD1) of a dermonecrotic protein from the Brazilian Loxosceles intermedia spider venom was expressed in Escherichia coli and purified by reversed-phase HPLC. Twenty five mg of rLiD1 was produced from liter of bacterial culture. The molecular weight of rLiD1 was verified by mass spectrometry (32,758 Da). rLiD1 displayed dermonecrotic and platelet aggregation activities. However, very low sphingomyelinase D and complement-dependent haemolytic activities were observed. Immunized BALB/c mice with rLiD1 developed an antibody response that reactead by ELISA with L. intermedia crude venom and cross-reacted with L. gaucho and L. laeta whole venoms. In vivo protection assay showed that 75% of the immunized mice resist to the challenge by 2.5 LD50 of L. intermedia venom (25 ìg). To characterize epitopes associated with protective antibodies, we prepare synthetic 15 mer overlapping peptides covering the complete amino acid sequences of the LiD1. Immunoassays revealed one antigenic region in the N-terminal of the molecule. The amino acid sequence of this epitope was found in other dermonecrotic proteins and some of its residues have been implicated with the active site of the toxin. This epitope was synthesized and used to raise antibodies in rabbits. Anti-peptide antibodies showed reactivity with rLiD1 and with L. intermedia whole venom and induced protections against dermonecrotic activity. Analysis with anti-Loxosceles serum (CPPI) revealed six different epitope regions. One epitope representative of each region was synthesized and utilized as antigenic mixture to immunize rabbits. Anti-peptides antibodies protect in vitro and in vivo dermonecrotic activity of rLiD1 at order of 80% and 60%, respectively. Therefore, antibodies against rLiD1 neutralized 100% of this activity. To evaluate the cross reactivity of anti-rLiD1 rabbit antibodies against others L. intermedia proteins, overlapping peptides of five proteins from dermonecrotic family (LiRecDT2, LiRecDT4, LiRecDT5, Loxtox i5, Loxtox i7) were synthesized. Anti-rLiD1 antibodies cross-react with all of them, showing two conserved regions. One of these regions was also found in SmaseI of L. laeta venom. Thirty-five continuous peptides mimicking discontinuous regions of rLiD1 were designed by using the bioinformatic tool PEPOP and prepared by Spot synthesis. Antibodies anti-rLiD1 recognized one discontinuous-continuous region. As conclusion, we can suggest that the use of synthetic peptides can be a good approach for anti-venom development. === Neste trabalho realizamos a expressao e purificacao de uma proteina com atividade dermonecrotica da aranha Loxosceles intermedia denominada rLiD1. Obtivemos um rendimento de 25, 8 mg de proteina por litro de cultura bacteriana. A massa de rLiD1 (32, 758Da) foi obtida por espectrometria de massas. Esta proteina apresentou tambem atividade de agregacao plaquetaria. No entanto, apresentou uma pequena atividade hemolica e esfingomielinasica. Camundongos Balb/c imunizados com rLiD1 foram capazes de produzir anticorpos que reagiram por ELISA com o veneno de L. intermedia e apresentaram reatividade cruzada com os venenos de L. gaucho e L. laeta. Ensaios de protecao in vivo mostraram que 75% dos camundongos imunizados com rLiD1 foram capazes de resistir ao desafio com 2.5 DL50 do veneno de L. intermedia (25 Êg). Com o objetivo de caracterizar os epitopos relativos aos anticorpos protetores, preparamos peptideos de 15 aminoacidos sobrepostos cobrindo a estrutura primaria de rLiD1. Imunoensaios com esses peptideos mostraram-nos uma regiao antigenica na extremidade N-terminal da molecula. Esse epitopo foi sintetizado e utilizado como imunogeno em coelhos. Anticorpos anti-peptideos mostraram reatividade com rLiD1 e com o veneno de L. intermedia e foram tambem capazes de induzirem protecao contra a atividade dermonecrotica. Os peptideos sobrepostos foram tambem analizados frente ao soro anti-Loxoscelico (CPPI), revelando-nos 6 diferentes regioes epitopicas. Um epitopo representativo de cada regiao foi sintetizado e utilizados como uma mistura antigenica para imunizar coelhos. Anticorpos anti-peptideos foram capazes de proteger a atividade dermonecrotica induzida por rLiD1 in vitro e in vivo cerca de 80% e 60%, respectivamente. Por outro lado, anticorpos anti-rLiD1 foram capazes de neutralizar 100% desta atividade. A fim de avaliar a reatividade cruzada dos anticorpos anti-rLiD1 frente a outras proteinas da familia das dermonecroticas, do veneno de L. intermedia (LiRecDT2, LiRecDT4, LiRecDT5, Loxtox i5, Loxtox i7), peptideos sobrepostos baseados em suas sequencias primarias foram sintetizados. Anticorpos anti-rLiD1 apresentaram reatividade com todas estas proteinas e reconheceram duas regioes comuns. Uma dessas regioes foi tambem encontrada em SMase I, do veneno de L. laeta. Alem disso, 35 peptideos continuos mimetizando regioes descontinuas de rLiD1 foram desenhados utilizando o programa de bioinformatica PEPOP. Estes peptideos foram sintetizados e anticorpos anti-rLiD1 reconheceram uma dessas regioes continuas-descontinuas. Como conclusao deste trabalho, sugerimos a possibilidade do uso de peptideos sinteticos na producao de anti-venenos.