Caracterização molecular, formação de biofilme e susceptibilidade a antimicrobianos de isolados de E. coli de aderência difusa Afa/Dr e não Afa/Dr

• Main Author: Fagundes, Laura Kreuz
• Other Authors: Piazza, Roxane Maria Pontes
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2015
• Subjects: 61; Escherichia coli; Biofilme
• Online Access: http://repositorio.ufes.br/handle/10/1344

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Laura Kreuz Fagundes.pdf: 1415672 bytes, checksum: 1fde045222456c682c0b2bccf12e7942 (MD5) Previous issue date: 2013-08 === A Escherichia coli de aderência difusa (DAEC), um patotipo diarreiogênico de E. coli, corresponde a um grupo heterogêneo sem marcador de virulência comum a todos os isolados e de papel controverso na diarreia infantil. O objetivo deste estudo foi caracterizar genotipica e fenotipicamente amostras de DAEC, portadoras e não portadoras de adesinas Afa/Dr, isoladas de crianças com e sem diarreia. Em 70 amostras de DAEC, PCR foi realizado para pesquisa de genes descritos em DAEC, EAEC ou UPEC, que codificam: (i) oito adesinas fimbriais e afimbriais (fimH, papC, sfa, aggA, aafA, agg3A, aidA/aah, afaC); (ii) cinco toxinas (pet, astA, set1A, sat, hlyA); (iii) três proteínas captadoras/receptora de ferro (irp2, iucA, chuA/shuA); (iv) invasina (daaD) e; antígeno 43 (agn43). Ensaio de formação de biofilme foi realizado a partir da bactéria cultivada em caldo Luria-Bertani e inoculada em placas de poliestireno com DMEM suplementado com 0,4% glicose. A leitura da densidade ótica (DO490) foi realizada após coloração com safranina. Soroaglutinação para 23 antígenos O (Probac do Brasil) foi realizada em 50% das DAEC. Método de difusão de disco foi realizado para testar a suscetibilidade a 13 antimicrobianos. A presença de pelo menos um gene que codifica adesinas, toxinas, proteínas captadoras/receptora de ferro, invasina ou antígeno 43 foram encontrados em 58,6%, 51,4%, 80%, 48,6% e 57,1%, respectivamente, com os genes fimH, irp2, agn43, iucA, chuA/shuA, presentes em mais de 50% das amostras. Gene afaC+ (PCR) e/ou sonda afaBC+ (hibridização de colônias) classificou 50% das DAEC como Afa/Dr, sendo pet, sat, irp2, iucA, chuA/shuA e agn43 significantes nessas amostras (p<0,05). Do total das DAEC, 44,3% foram formadoras de biofilme, igualmente distribuídas entre as Afa/Dr e não Afa/Dr, e nenhum gene foi associado com esse fenótipo. Sorologia de 35 amostras evidenciou os seguintes sorogrupos: 1 O29, 2 O125, 2 O127 e 7 O86. Todas as O86 foram de DAEC Afa/Dr. Maiores frequências de resistência antimicrobiana foram encontradas para ampicilina (55,7%), sulfametoxazol/trimetoprim (35,7%) e tetraciclina (28,6%) e o perfil resistente/intermediário para amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, sulfametoxazol/trimetoprim foi significante nas DAEC Afa/Dr, assim como a multi-droga resistência (p<0,05). Em conclusão, observou-se: (i) alta frequência de fimH e pet e presença de agn43, até então não descrito em DAEC, em frequências similares àquelas encontradas em EAEC, UPEC e EAEC/UPEC, respectivamente; (ii) que as amostras de DAEC Afa/Dr e não Afa/Dr constituíram grupos com perfis genéticos diferenciados entre si; (iii) poucos sorogrupos foram encontrados entre as DAEC; (iv) frequências de resistência menores quando comparado com as poucas descrições em DAEC, sugerindo uma menor pressão seletiva da população do presente estudo e; (v) amostras de DAEC Afa/Dr podem representar um importante reservatório de genes de resistência a antimicrobianos, além de diversos fatores de virulência. === The diffusely adherent Escherichia coli (DAEC), a diarrheagenic pathotype of E. coli, represent a heterogeneous group without a virulence marker common to all isolates and with a controversial role in childhood diarrhea. The aim of this study was to characterize phenotypic and genotypic samples of DAEC, with or without Afa/Dr adhesins, isolated from children with and without diarrhea. In 70 samples DAEC, PCR was performed to search for genes described in DAEC, EAEC or UPEC, encoding: (i) eight fimbrials and afimbrials (fimH, papC, sfa, aggA, aafA, agg3A, aida/aah, afaC ), (ii) five toxins (pet, astA, set1A, sat, hlyA), (iii) three iron-chelators (irp2, yucA, chuA/shuA), (iv) invasin (daad) and; antigen 43 (agn43). Biofilm formation assay was carried out from the bacteria grown in Luria-Bertani broth and inoculated in microtiter plates with DMEM 0.4% glucose. Optical density (OD490) was measured after safranin staining. Seroagglutination for 23 O antigens (Probac Brazil) was performed in 50% of DAEC strains. Disk diffusion method was conducted to test the susceptibility to 13 antimicrobial agents. The presence of at least one gene encoding for adhesins, toxins, iron chelators or invasin were found in 58.6%, 51.4%, 80% and 48.6%, respectively, with the genes fimH, irp2, agn43, yucA, chuA/shuA, present in over 50% of the strains. afaC+ gene (PCR+) and/or afaBC+ probe (colony hybridization) classified 50% of DAEC as Afa/Dr, being pet, sat, irp2, yucA, chuA/shuA and agn43 significant in these strains (p<0,05). Ou of the 70 DAEC, 44.3% were biofilm former, equally present among Afa/Dr and non Afa/Dr, and no gene has been associated with this phenotype. Serology of 35 strains showed the following serogroups: 1 O29, 2 O125, 2 O127 and 7 O86. All O86 were DAEC Afa/Dr. Higher frequency of antimicrobial resistance were found for ampicillin (55.7%), trimethoprim/sulfamethoxazole (35.7%) and tetracycline (28.6%) and the pattern resistant/intermediate to amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, sulfamethoxazole/trimethoprim was significant in Afa/Dr DAEC, as well as the multi-drug resistance (p <0.05). In conclusion, we observed: (i) a high frequency of fimH and pet and the presence of agn43, hitherto not described in DAEC, at similar frequencies to those found in EAEC, UPEC and EAEC/UPEC, respectively; (ii) that the samples Afa/Dr and non Afa/Dr DAEC constituted groups with different genetic profiles to each other; (iii) a few serogroups were found among DAEC; (iv) smaller resistance frequencies when compared with the few descriptions of DAEC, suggesting a lower selective pressure of the population of the present study and; (v) DAEC Afa/Dr strains may represent an important reservoir of antibiotic resistance genes, beyond several virulence factors.