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TESE Ricardo de Souza Silva.pdf: 2617103 bytes, checksum: 83ada60ae5dc3c77a19892b0c337a3d7 (MD5) === Made available in DSpace on 2015-03-13T12:52:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2
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Previous issue date: 2014 === CAPES === Métodos de separação por afinidade têm se revelado eficazes e econômicos. Eles se baseiam
na formação de um complexo estabelecido entre duas biomoléculas afins a um suporte
insolúvel em água. Lavagens iniciais deste compósito removem impurezas de sorte que em
uma segunda etapa o complexo é desfeito, liberando a biomolécula de interesse mediante seu
rompimento (força iônica, pH, etc.). Dentre os diferentes métodos, aqueles baseados em
suportes magnéticos têm as vantagens de fácil síntese, manuseio e o derivado ser recuperado
por meio de um campo magnético. Esta tese se postulou a revestir partícula magnéticas com
heparina (HEP) e heparan sulfato (HS) uma vez que esses glicosaminoglicanos são muito
negativamente carregados e formam complexos com proteínas, por exemplo, proteínas
plasmáticas. Três tipos de materiais foram sintetizados: polietilenotereftalato magnetizado
(mPET), magnetita (MAG) e magnetita revestida com polianilina (mPANI). Inicialmente,
filmes de PET sofreram hidrazinólise e o pó PET-hidrazida obtido foi magnetizado pelo
método de co-precipitação em solução de cloretos férrico e ferroso. A MAG foi sintetizada
conforme descrito acima, porém, sem adição do PET, e posteriormente foi revestida com
PANI (mPANI). HEP e HS foram ativados com carbodiimida e N-hidroxissuccinimida e
incubados com os suportes para que ocorressem o revestimento das partículas, produzindo os
seguintes derivados magnéticos: mPET-HEP; mPANI-HEP; MAG-HEP; mPET-HS e
mPANI-HS. As amostras de mPET-HEP foram investigadas por análise elementar e
espectroscopia de infravermelho. A composição centesimal delas mostrou um aumento na
razão carbono : nitrogênio, presumindo ser devido à imobilização de heparina. O espectro de
infravermelho do derivado contendo heparina apresentou bandas em 1653 cm-1 e 1547 cm-1,
característicos da ligação amida, formada pela conjugação. O derivado mPANI imobilizou
cerca de 37% da heparina ofertada, embora a magnetita pura (MAG) também tenha
imobilizado, porém em menor grau. Todas estas matrizes demonstraram uma boa estabilidade
em 10 ciclos consecutivos de reutilização mesmo após 2 anos estocadas a 4°C. Quanto ao HS,
este foi covalentemente fixado às partículas mPANI e mPET em torno de 35 μg e 38,6 μg por
mg de suporte respectivamente, no entanto também foi adsorvido (18μg/mg) sobre as
partículas controle de MAG. Indícios do sucesso da imobilização nestes compósitos foram a
demonstração de que a heparina fixava o corante azul de metileno e retardava o tempo de
coagulação do plasma recalcificado quando em contato com estes suportes. Finalmente, todos
os derivados magnéticos foram incubados com plasma humano e lavados posteriormente com
gradientes de NaCl para liberar as proteínas fixadas e detectá-las a 280nm. Eletroforese destas
proteínas revelaram bandas referentes à antitrombina (58kDa) e as suas dosagens nos plasmas
e eluatos confirmaram a eficiência do método de separação. Nos derivados mPET-HS e
mPANI-HS, além da antitrombina, importantes fatores da coagulação também foram
observados na eletroforese e comprovada a sua separação através de testes de coagulação
específicos. Portanto, os resultados mostraram que estes compósitos produzidos são
promissores na purificação da antitrombina e outros fatores da coagulação presentes no
plasma humano.
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