Expressão diferencial e transformação genética de uma defensina de Momordica charantia em Vigna unguiculata

• Main Author: FERREIRA, José Diogo Cavalcanti
• Other Authors: BENKO-ISEPPON, Ana Maria
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Pernambuco 2017
• Subjects: Transgênicos; bioinformática; peptídeo antimicrobiano (AMP); defensinas; fitopatógenos
• Online Access: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/20791

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa ([e-mail]) on 2017-08-22T13:09:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_DiogoCavalcanti_BC.pdf: 3366342 bytes, checksum: 1cb002141032824ff8d879898ca1256e (MD5) === Made available in DSpace on 2017-08-22T13:09:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_DiogoCavalcanti_BC.pdf: 3366342 bytes, checksum: 1cb002141032824ff8d879898ca1256e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 === FACEPE === O aumento da produtividade agrícola é impactado negativamente por estresses bióticos e abióticos, que são os principais responsáveis pela drástica redução da produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata). Para se defender dos estresses bióticos, os vegetais desenvolveram sofisticados mecanismos, incluindo o sistema de defesa pré-invasivo, localizado nas partes externas dos vegetais e impedindo a entrada do patógeno, e a imunidade inata, que reconhece estruturas fundamentais dos microorganismos e induz a produção de proteínas de combate aos patógenos. Dentre elas as defensinas, que inviabilizam o estabelecimento de agentes invasores. Por sua vez, o melão-de-são-caetano (Momordica charantia) dispõe de transcriptoma sequenciado e destaca-se pelo seu potencial antimicrobiano. A partir de análises in silico no transcriptoma dessa espécie foram selecionados cinco genes-candidatos da classe das defensinas. Destes, o gene McDef1 apresentou domínio conservado completo com predição de atividade antifúngica. A defensina McDef1 exibe regiões conservadas na maioria das defensinas de plantas incluindo oito cisteínas, uma serina na posição 8, um aminoácido aromático na posição 11 e resíduos de glicina nas posições 13 e 34. Após análise fenéticas a McDef1 foi agrupada com outras defensinas já descritas com atividades antifúngicas in vitro e/ou in vivo, o que reforça a predição revelada pelas análises in silico. Um vetor pAHASMCDEF1, portando o gene McDef1 e Atahas, que confere resistência ao herbicida Imazapyr, foi construído e utilizado para bombardear 880 embriões de feijão-caupi através da técnica de biobalística. Destes, sete plantas transformadas foram geradas, com eficiência de transformação semelhante àquela de trabalhos anteriores com feijão-caupi. As próximas etapas compreendem a multiplicação das plantas transformadas até a geração T3, após o que as mesmas serão inoculadas com fungos fitopatogênicos, os quais podem causar perdas de até 50% na produção em feijão-caupi. === Increased agricultural productivity is negatively impacted by biotic and abiotic stresses, that are responsibles for the drastic reduction in cowpea (Vigna unguiculata) production. To defend against biotic stresses, plants have developed sophisticated mechanisms including a pre-invasive defense system, located in the external parts of plants to prevent pathogenic entry, and the innate immunity, which recognizes fundamental structures of microorganisms and induces proteins production that avoid the pathogen establishment. Among them defensins, that prevent the establishment of invading agents. In turn, the bitter melon (Momordica charantia) disposes a sequenced transcriptome and stands out for its antimicrobial potential. After an in silico analysis of M. charantia transcriptome, five defensin gene candidates were selected. Of these, McDef1 gene exhibited a complete conserved domain with prediction of its antifungal activity. The McDef1 defensin displayed conserved regions similar to most plant defensins including eight cysteines, a serine at position 8, an aromatic amino acid at position 11 and glycine residues at positions 13 and 34. After phenetic analyzes, McDef1 was grouped with other defensins previously described with in vitro and/or in vivo antifungal activity, reinforcing the in silico prediction analysis. A pAHASMCDEF1 vector was constructed, bearing the McDef1 and Atahas gene, which confers resistance to the herbicide Imazapyr, being used for bombardment of 880 cowpea embryos by biolistic technique. Of these, seven transformed plants were generated, with transformation efficiency similar to previous reports for cowpea. The next steps include the multiplication of transformed plants up to the T3 generation, after which they will be inoculated with pathogenic fungi, which can cause losses of up to 50% in cowpea production.