Desenvolvimento de nanopartículas híbridas para terapia por RNA de interferência

• Main Author: Souza, Gabriela Regina Rosa
• Other Authors: Universidade Federal de Santa Catarina
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2017
• Subjects: Farmácia; Nanopartículas; Copolímeros; Mamas; Câncer
• Online Access: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/174025

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. === Made available in DSpace on 2017-03-14T04:08:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339588.pdf: 2300927 bytes, checksum: dd97ff2d496091b10a5e870e79db18da (MD5) Previous issue date: 2016 === Desde a elucidação do mecanismo molecular do efeito RNA de interferência (RNAi), sequências de short interfering RNA (siRNA) emergiram como potenciais agentes terapêuticos para modular a produção de proteínas relacionadas à doenças envolvidas na desregulação genética. Entretanto, a aplicação clínica do siRNA depende do desenvolvimento de sistemas de entrega seguros e eficientes para as células alvo, uma vez que o siRNA é facilmente degradado por nucleases endógenas, a absorção celular é ineficiente, além de ocorrer aprisionamento e degradação das moléculas nos endossomos celulares. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi o desenvolvimento de um sistema de entrega eficiente para proteger e entregar o siRNA às células de câncer de mama, visando o uso na terapia anti-câncer. Para tanto, nanopartículas híbridas compostas de fosfato de cálcio e copolímero foram preparadas, caracterizadas e testadas em células. As nanopartículas foram formadas por auto-associação, através de mistura simples e estequiométrica de soluções iônicas aquosas contendo siRNA e copolímero. As medidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS) indicaram uma distribuição de tamanho estreita com diâmetro médio em 53 ± 4 nm e índice de polidisperção (PdI) de 0,09 ± 0,02. A carga superficial das nanopartículas foi de 0,25 ± 0,22 mV. As imagens de TEM revelaram nanopartículas com forma arredondada relativamente homogênea, com tamanho médio de 47 ± 18 nm. A concentração de partículas foi de 1,72x1012/mL. A porcentagem de siRNA complexado nas nanopartículas foi de 45%, conforme quantificado por pelo kit Quanti-iT microRNA Assay e visualizado por gel de agarose. O sistema desenvolvido permaneceu estável durante a incubação prolongada a 4ºC e por 7 dias quando submetido ao congelamento/descongelamento. Observou-se que os processos de liofilização, purificação e adição ao meio de cultura de células não alteraram o tamanho e o PdI das nanopartículas. Os ensaios de Espectroscopia de Emissão de Fotoelétrons Excitados por raios X (XPS) e Espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDS) sugeriram a presença dos elementos oxigênio, cálcio, fósforo, nitrogênio e carbono na composição das nanopartículas indicando associação conforme a hipótese levantada. As nanopartículas contendo o siRNA para AKT3 e SETD4 reduziram a viabilidade celular de maneira dependente de concentração e do tempo quando comparadas com os respectivos controles. As nanopartículas não foram citotóxicas para a linhagem celular não tumoral NIH-3T3. As nanopartículas híbridas mostraram-se eficientes no carreamento e entrega do siRNA, uma vez que foi possível observar silenciamento de 46 ± 13% para o gene AKT3 e 42 ± 34% para SETD4. Por microscopia confocal confirmou-se a capacidade do sistema nanoparticulado em carrear siRNA e promover o escape endossomal. Os resultados obtidos demonstram a nanopartícula híbrida como uma candidata promissora na entrega de siRNA para genes importantes na sobrevivência de células de câncer de mama.<br> === Abstract : Since elucidation of the molecular pathway of ribonucleic acid interference (RNAi), short interfering ribonucleic acid (siRNA) has emerged as a potential therapeutic agent for modulating the production of proteins associated with diseases involved in gene disruption. However, the clinical application of siRNA requires safe and effective methods for their delivery to the target cell, due to the siRNA degradation by nucleases, inefficient cellular uptake and endosomal entrapment. Thus, the aim of the present study was the development of an efficient carrier system to protect and deliver siRNA to breast cancer cells for anti-cancer therapy. Therefore, hybrid nanoparticles composed of calcium phosphate and block copolymer were prepared, characterized and tested biologically. The nanoparticles were formed through self-assembly by simple mixing of aqueous ionic solutions of the components in stoichometric condition, in the presence of siRNA and block copolymer. Dynamic Light Scattering (DLS) measurements showed a narrow distribution with an average value of 53 ± 4 nm and Polydispersity Index (PdI) of 0.09 ± 0.02. The surface charge of nanoparticles was 0.25 mV ± 0.22 mV. The TEM observations revealed nanoparticles with relatively homogenous rounded shape with an average size of 47 ± 18 nm. The concentration of particles per mL was 1.72x1012. The siRNA-loading efficiency was 45%, as quantified by the Quant-iT microRNA Assay kit and visualized by agarose gel electrophoresis. The developed system remained stable during prolonged incubation at 4 °C, and for 7 days when subjected to freeze/thaw. It was noted that the freeze-drying processes, purification as well as the presence of cell culture medium did not change the size and PdI of the nanoparticles. Photoelectron spectroscopy Emission Excited by X-ray (XPS) and X-ray spectroscopy for energy dispersion (EDS) suggest the presence of oxygen, calcium, phosphorus, nitrogen and carbon in the composition of nanoparticles, indicating association as the hypothesis of nanoparticles formation. Nanoparticles containing siRNA to AKT3 and SETD4 significantly reduced cell viability in a concentration- and time-dependent manner, when compared to the control. Nanoparticles are not cytotoxic to NIH-3T3 cell line (non-tumoral). The hybrid nanoparticle was efficient in loading and delivering siRNA, since it was observed a AKT3 and SETD4 gene silencing of 46 ± 13% and 42 ± 34%, respectively. By confocal microscopy the abilities of the nanoparticulate system to deliver siRNA and to promote endosomal escape were confirmed. The results obtained demonstrate the hybrid nanoparticles as a promising candidate for the delivery of siRNA to silence key genes in the survival of breast cancer cells.