Estudos metabólicos, enzimáticos e genéticos do fungo endofítico Penicillium brasilianum

• Main Author: Fill, Taícia Pacheco
• Other Authors: Rodrigues Filho, Edson
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de São Carlos 2016
• Subjects: Biossíntese; Produtos naturais; Brasiliamidas; Fenilalanina amônia-liase; Fungos endofíticos; Penicillium brasilianum; CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA
• Online Access: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/6298

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 === Universidade Federal de Minas Gerais === The project "Metabolic, enzymatic and genetic studies of the endophytic fungus P. brasilianum" resulted in biosynthetic studies of bisphenylpropanoid amides, the brasilimides, confirming the origin of these substances via phenylpropanoid biosynthesis pathway, very unusual in fungi. PAL activity, the first enzyme involved in this biosynthetic route was successfully evaluated and the conditions of PAL production by P. brasilianum were optimized (culture medium and induction of PAL adding Phe to the culture), and the incubation conditions of the enzymatic reaction. The specificity of the PAL enzyme was studied, and the enzyme showed activity toward all substrates tested, including acting as TAL (tyrosine ammonia lyase). In vivo studies throught the addition of different substrates lead to N-acetylation confirmed by spectroscopy data. The genome of the fungus P. brasilianum was sequenced, and extensive studies through bioinformatics lead to the gene encoding PAL enzyme. From molecular biology studies, the enzyme was cloned and expressed as recombinant PAL fused to a SUMO protein and a his-tag at the N- terminus of the protein in pETSUMO vector expressed in E. coli BL21 (DE3) to obtain the best conditions for enzyme overexpression in its soluble form. The purification process of the recombinant enzyme was studied from a single purification step (affinity chromatography) by pH gradient elution, obtaining a high degree of purity confirmed by one-dimensional electrophoresis. The pure recombinant PAL enzyme obtained was characterized by MS and biochemically yielding Km values of 4,8 mM. Recent studies seem to point out that there is a relationship between the production of brasiliamides when the fungus is subjected to stress conditions. The PAL enzyme appears to be involved in defense mechanisms in this fungus, as has been described for plants. === O projeto "Estudos metabólicos, enzimáticos e genéticos do fungo endofítico P. brasilianum" tratou de investigações biossintéticas das amidas bisfenilpropanoídicas, as brasiliamidas, confirmando a origem fenilpropanoídica destas substâncias, muito incomum em fungos. A atividade da enzima Fenilalanina amônia-liase, primeira da rota biossintética, foi avaliada pela primeira vez no fungo em estudo, e as condições da produção de PAL por P. brasilianum foram otimizadas (meio de cultivo e indução ao adicionar fenilalanina ao cultivo), assim como as condições de incubação da reação enzimática. A especificidade da enzima foi determinada a qual se apresentou altamente promíscua em todos os substratos testados, inclusive atuando como TAL (tirosina amônia-liase). In vivo, a adição de diferentes precursores ao meio de cultivo levou a N-acetilação destes confirmado por dados espectroscópicos. O genoma do fungo P. brasilianum foi sequenciado, e através de extensos estudos de bioinformática pode-se determinar o gene que codifica a enzima PAL. A partir de estudos de biologia molecular foi possível clonar e expressar a enzima PAL recombinante fusionada a uma proteína SUMO e uma cauda polihis no N-terminal da proteína em vetor pETSUMO expresso em E. coli BL21(DE3) obtendo-se, dessa maneira, as melhores condições para superexpressão enzimática na forma solúvel. O processo de purificação da enzima recombinante foi estudado a partir de um único passo de purificação (coluna de afinidade) por gradiente de pH, obtendo alto grau de pureza comprovado através de eletroforese monodimensional. A enzima PAL recombinante pura obtida foi caracterizada por MS e bioquimicamente obtendose valores de Km de 4,8 mM. Estudos parecem deixar claro que exista uma relação entre a produção de brasiliamida A quando o fungo é submetido a situações de estresse, seguindo mesmo comportamento relatado em plantas e, portanto, a enzima PAL parece estar envolvida em mecanismos de defesa neste fungo.