Nanopartículas de prata na presença de ácido húmico em meio aquoso : caracterização físico-química e avaliação toxicológica em modelo zebrafish (Danio rerio)

• Main Author: Cáceres Vélez, Paolin Rocio
• Other Authors: Grisolia, Cesar Toppe
• Language: Portuguese
• Published: 2017
• Subjects: Nanopartículas de prata; Ácido húmico; Biologia - citologia - nanoestruturas; Biorremediação; Peixe-zebra
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/23509

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. === Submitted by Raquel Almeida ([e-mail]) on 2017-05-15T17:11:45Z No. of bitstreams: 1 2017_PaolinRocioCáceresVélez.pdf: 6744794 bytes, checksum: c2635fa46c76e0021861f2ba5269f45c (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana ([e-mail]) on 2017-05-16T19:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_PaolinRocioCáceresVélez.pdf: 6744794 bytes, checksum: c2635fa46c76e0021861f2ba5269f45c (MD5) === Made available in DSpace on 2017-05-16T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_PaolinRocioCáceresVélez.pdf: 6744794 bytes, checksum: c2635fa46c76e0021861f2ba5269f45c (MD5) Previous issue date: 2017-05-16 === A produção e o amplo uso de nanomateriais como as nanopartículas de prata (AgNP) resultam no contato inevitável com o meio ambiente. Em ambientes naturais, as AgNP também podem formar sedimentos por adsorção com matéria orgânica, como o ácido húmico (AH), alterando a sua biodisponibilidade e toxicidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento físico-químico das AgNP na presença do AH em diferentes meios aquosos (água ultrapura-MQ, água do sistema de manutenção do zebrafish- SIST e água reconstituída-REC) e avaliar os efeitos toxicológicos, em embriões e peixes adultos de zebrafish (Danio rerio), das AgNP na presença e ausência do AH. As AgNP com sem a presença de AH foram caracterizadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), difração de raios X (DRX), espectroscopia no infravermelho por reflectância total atenuada (FTIR-ATR) e espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS). Embriões (n=20/grupo) com 2 horas pós-fertilização (hpf) foram expostos a AgNP (0; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4,75; 6,5; 8,5 e 10 mg/L), com e sem a presença de AH (20 mg/L), para determinar a CL50 e avaliar o desenvolvimento embrionário durante 96 horas. Após 96 hpf, as larvas foram coletadas para analisar a incorporação de prata por ICP-MS. Por outro lado, peixes adultos (n=7/grupo) foram expostos a 0, 10, 20, 30, 40 e 60 mg/L de AgNP, com e sem AH (20 mg/L). Após 96h de exposição, foi determinada a CL50, os peixes adultos foram eutanizados a fim de coletar eritrócitos de sangue periférico para o teste de cometa, micronúcleo - MN e anormalidades nucleares - AN. As brânquias, fígado e intestino dos peixes foram coletados para análises histopatológicas por microscopia de luz e para avaliação da biodistribuição da prata por ICP-MS. Na análise por TEM observou-se que as AgNP têm formato variável e irregular, com diâmetro médio 26±16 nm. A complexação do AH com as AgNP (AgNP+AH) foi observada por ATR-FTIR e corroborada por TEM e XPS. As análises de XPS indicaram também que a superfície das AgNP suspendidas em água MQ e SIST não foi oxidada (Ag0) pela presença do AH, mas a superfície das AgNP suspendidas em água REC com a presença do AH foi oxidada para Ag3+. A CL50 calculada para embriões de zebrafish expostos a AgNP foi de 1,19 mg/L AgNP, enquanto que para os expostos a AgNP na presença de AH a CL50 foi de 3,56 mg/L AgNP. As larvas expostas a AgNP apresentam fenótipos com atraso no desenvolvimento (p≤0,05) em concentrações maior ou igual a 1 mg/L de AgNP, incluindo baixa viabilidade, edema generalizado, atraso na eclosão e absorção do saco vitelínico. Alterações no equilíbrio e edema cardíaco foram estatisticamente diferentes em concentrações acima de 0,25 e 0,5 mg/L AgNP, respectivamente. As malformações observadas foram estatisticamente significativas em concentrações de 1 e 1,5 mg/L de AgNP. Em contraste, os embriões expostos a AgNP na presença de AH mostraram uma diminuição significativa na frequência de todas as alterações mencionadas anteriormente. Nos testes in vivo com zebrafish adultos, os valores da LC50 para peixes expostos a AgNP foi de 25,0 mg/L e para os grupos expostos a AgNP com AH foi de 40,56 mg/L. A fragmentação do DNA, avaliada pelo teste de cometa e MN, não foi estatisticamente significativa (p>0,05) para os grupos expostos a 10, 20, 30 mg/L de AgNP, com ou sem a presença de AH, quando comparados com o grupo controle. Em contraste, o teste de AN mostrou diferenças significativas na frequência de células binucleadas. Apesar da presença de algumas alterações histológicas nas brânquias tais como hipertrofia de células de cloro e células epiteliais lamelares, levantamento do epitélio lamelar, hiperplasia de células mucosas, fusão lamelar e aneurismas, não houve diferenças estatisticamente significativas tanto para os peixes expostos às AgNP quanto para os expostos às AgNP+AH, quando comparado com o grupo controle. No fígado e intestino dos peixes expostos a AgNP e AgNP+AH não foram observadas alterações histológicas não obstante a análise por EDX indicou a presença de prata no lúmen intestinal. Embora os biomarcadores genotóxicos e histopatológicos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos expostos (AgNP e AgNP+AH), o aumentos nos valores da CL50 do grupo AgNP+AH (quando comparada com a CL50 do grupo exposto a AgNP) pode estar relacionada com a presença do AH na água. Considerando os resultados obtidos no nosso estudo, a toxicidade e biodisponibilidade das AgNP pode diminuir em ambientes aquáticos contendo AH, devido ao AH através dos seus grupos carboxílicos e fenólicos podem formar complexos fortes com as AgNP. Assim, a presença de ácido húmico em ambientes aquáticos aparece como um atenuador/remediador natural da água poluída com nanopartículas de prata. === The extensive production and use of nanomaterials, such as silver nanoparticles (AgNP), result in their inevitable release into the environment which may harm some organisms. Moreover, nanoparticles can also form sediments by adsorption with natural organic matter (NOM), such as humic acid (HA), changing their bioavailability and toxicity. The aim of this work is to evaluate the physical-chemical behavior of AgNP in different aqueous medium (ultrapure water-UPW, zebrafish facility water-ZFW and zebrafish growing media-ZGM) and to assess their toxicological effects in embryos and adult zebrafish (Danio rerio). The study was carried out both in presence (AgNP+HA) and absence of HA in order to investigate the interaction this NOM on the AgNP. All materials were characterized by dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM), x-ray diffraction (XRD), attenuated total reflectance infrared spectroscopy (FTIR-ATR) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). In order to calculate the LC50 and to assess the embryo-larval toxicity, two hours post-fertilization (hpf) zebrafish embryos (n=20/group) were exposed during 96 hours to AgNP (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4.75, 6.5, 8.5, and 10 mg/L) both with and without the presence of HA (20mg/L). After 96 hpf, zebrafish larvae were collected to analyze silver uptake. Additionally, adult fish were exposed for 96h to 0, 10, 20, 30, 40 and 60 mg/L of AgNP, with and without HA (20 mg/L). The LC50 was calculated and fish (n=7/group) were euthanized to collect peripheral blood erythrocytes for comet assay, micronucleus (MN), and nuclear abnormalities (NA) tests. Gills, livers, and intestines were collected for biodistribution and histopathological assessment. TEM analysis showed that AgNP have variable and irregular shape, with an average diameter of 26±16 nm. The complexation of HA with AgNP (AgNP+HA) was observed by FTIR-ATR analysis and corroborated by TEM and XPS. XPS assays also indicated that the surface of AgNP suspended in UPW and ZGM was not oxidized (Ag0) by the presence of HA, but the surface of AgNP suspended in ZGM with the presence of HA was oxidized to Ag3+. The calculated LC50 for zebrafish embryos exposed to AgNP was 1.19 mg/L, while the LC50 for AgNP+HA was 3.56 mg/L. The larvae exposed to AgNP displayed developmental delay phenotypes (p≤0.05) with concentrations of at least 1 mg/L AgNP, including lower viability, generalized edema, delays in hatching and yolk sac absorption. Alterations in body balance and cardiac edema were statistically different at concentrations above 0.25 and 0.5 mg/L, respectively. Observed malformations were statistically significants at 1 and 1.5 mg/L of AgNP. In contrast, embryos exposed to AgNP+HA showed a significant decrease in the frequency of the aformentioned alterations. The LC50 value for adult zebrafish exposed to AgNP was 25.0 mg/L, while for groups exposed to AgNP+HA was 40.56 mg/L. DNA fragmentation was not statistically significant (p>0.05) for groups exposed to 10, 20, 30 mg/L of AgNP with or without HA, when compared with the control group. In contrast, NA test showed significant differences of binucleated cells when compared with the control group. Although some gill histological alterations were observed (chloride cell and lamellar epithelial cell hypertrophy, lamellar epithelial lifting, mucosal cell hyperplasia, lamellar fusion, and aneurysms), there were no statistically significant differences for both AgNP and AgNP+HA when compared with the control group. EDX analysis showed the presence of AgNP in the intestinal lumen, but no histological changes were observed in the intestine and liver of fish exposed to AgNP and AgNP+HA. Considering the results obtained in our study, the toxicity and bioavailability of AgNP in zebrafish can decrease in environments with HA, since HA can form strong complexes between its carboxylic and phenolic groups with the AgNP. Thus, the presence of humic acid in aquatic environments appears as a natural attenuator/remediator of water polluted with silver nanoparticles.