| Summary: | Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Laboratório da Interação Parasito-Hospedeiro, 2008. === Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-30T18:33:48Z
No. of bitstreams: 1
2008_MeireMariadeLima.pdf: 2224259 bytes, checksum: 392adeabf9cda08bfe409fb7327df412 (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-07-03T21:32:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2008_MeireMariadeLima.pdf: 2224259 bytes, checksum: 392adeabf9cda08bfe409fb7327df412 (MD5) === Made available in DSpace on 2011-07-03T21:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2008_MeireMariadeLima.pdf: 2224259 bytes, checksum: 392adeabf9cda08bfe409fb7327df412 (MD5) === Trypanosoma brucei secreta uma prolil oligopeptidase (POPTb) que parece estar envolvida na patogênese da doença do sono. Essa enzima é capaz de hidrolizar hormônios peptídicos contendo resíduos de prolina e considerada um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas contra a patologia. Como a estrutura tridimensional da POPTb ainda não foi resolvida, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência foram utilizados para estudo da estrutura e estabilidade da enzima bem como para a identificação de aditivos que possam ser utilizados nos experimentos de cristalização e na estocagem da proteína. Parâmetros termodinâmicos e estruturais foram calculados a partir de experimentos de desnaturação térmica e química e de estudos de atenuação da fluorescência. Cloreto de guanidina (GuHCl) promoveu a desnaturação da proteína em concentrações quase 30% menores que uréia. Divergência encontrada nos valores de ΔG determinados a partir de experimentos de desnaturação química e térmica sugere a presença de intermediários no processo de desdobramento da proteína. Sugere, também, maior estabilidade estrutural. Sorbitol se mostrou capaz de estabilizar a POPTb enquanto brometo de hexadecil-trimetilamônia (CTAB), na concentração de 0,1 mM, provocou o efeito oposto levando à quase total inatividade da enzima. A ação do ditiotreitol (DTT) é pH-dependente, reduzindo a estabilidade da enzima em pH neutro e aumentando-a em pH alkalino. Experimetos de atenuação da fluorescência mostraram dependência do pH e heterogeneidade no ambiente dos triptofanos com pelo menos um resíduo desse aminoácido próximo ao sítio ativo. A enzima parece estar menos sujeita a alterações conformacionais em pH 7.5. A elevação da temperatura resultou na redução da concentração micelar crítica (cmc) do CTAB. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT === Trypanosoma brucei secrets a prolyl oligopeptidase (POPTb) which is possibly involved in the pathogenesis of sleeping sickness. It is able to hydrolyze prolinecontaining peptide hormones and is therefore considered a good target for the development of drugs to treat the disease. As the crystal structure of POPTb has not been solved yet, we used circular dichroism and fluorescence spectroscopy to gain some knowledge on the enzyme structure, stability and on additive effects for both crystallization assays and storage. Thermodynamic and structural parameters were calculated from thermal and chemical denaturation studies as well as from fluorescence quenching experiments, respectively. The concentration of guanidine hydrochloride (GuHCl) that led to protein denaturation was nearly 30% that of urea needed to reach the same effect. Divergence in the ΔG values derived from chemical and thermal unfolding assays suggests the presence of intermediate states in the process. It also suggests higher structural stability. Sorbitol increases enzyme stability and 0.1 mM cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) decreases it almost halting enzyme activity. Ditiotreitol (DTT), however, has the former effect in alkaline pH and the latter effect in neutral pH. Fluorescence quenching experiments show dependence on pH and indicate heterogeneity in the environment of the surface-accessible tryptophan residues with at least one such residue near the enzyme active site. POPTb molecule seems to be less subjected to conformational changes at pH 7.5. The increase in temperature lowers CTAB critical micelle concentration (cmc).
|
|---|
