Sintese de galactooligossacarideos por B-galactosidase de Scopulariopsis sp a partir da lactose

• Main Author: Almeida, Mareci Mendes de
• Other Authors: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: [s.n.] 2003
• Subjects: Fermentação; Lactose; Bactérias; B-galactosidase; Fermentation
• Online Access: ALMEIDA, Mareci Mendes de. Sintese de galactooligossacarideos por B-galactosidase de Scopulariopsis sp a partir da lactose. 2003. 162p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/256719>. Acesso em: 3 ago. 2018.; http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/256719

Orientador: Glaucia Maria Postore === Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos === Made available in DSpace on 2018-08-03T17:17:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_MareciMendesde_D.pdf: 1394335 bytes, checksum: aeb99b8a1fe68ffc5a8b6d83ce4b6809 (MD5) Previous issue date: 2003 === Resumo: Os galactooligossacarídeos são produzidos a partir da lactose por ação da B-galactosidase com atividade de transgalactosilação. São carboidratos não digeríveis, sendo resistentes às enzimas digestivas e fermentados por bifidobactérias. Os benefícios da ingestão de galactooligossacarídeos são de elevar a população de bifidobactérias no cólon e por efeito antagônico, suprimir a atividade de bactérias putrefativas e reduzir a formação de produtos tóxicos por fermentação. O microrganismo Scopulariopsis sp acumulou grande quantidade de B-galactosidase por fermentação semi-sólida e a enzima foi produzida constitutivamente. A enzima obtida foi fracionada com sulfato de amônio, acetona e etanol, sendo a precipitação com sulfato de amônio a que apresentou melhores resultados. O extrato enzimático foi caracterizado bioquimicamente, apresentando um pH ótimo de 4,5 e temperatura ótima de 65°C, e a estabilidade enzimática foi em pH 5,0 e 50°C. A enzima apresentou atividade de transgalactosilação quando avaliada por cromatografia de papel. A b-?galactosidase extracelular de Scopulariopsis sp foi semi-purificada e caracterizada. A enzima foi semi-purificada 13 vezes com um rendimento de aproximadamente 14%. O peso molecular da enzima foi estimado por filtração em gel em torno de 98 KDa. Algumas características da enzima foram determinadas usando o-nitrofenil-??galactopiranosideo (ONPG) como substrato. O pH e temperatura ótimos de atividade foram em torno de 4,5 e 60°C, respectivamente. A enzima foi estável em 40°C por 24 horas e pH 5,0. Os valores de Km e Vmax para ONPG foram 2,28mM e 123?moles/mL/min, respectivamente. Os cátions Fe+2, Fe+3 e Mn+2 ativaram a enzima e N-bromosuccinimida inibiu sua atividade. A atividade de transgalactosilação da ??galactosidase foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência. A temperatura ótima para atividade de galactosiltransferase foi entre 35 e 45°C e o efeito do pH foi mínimo em alta concentração de lactose; a concentração de enzima para síntese de GOS foi 4-6 U/mL. Quando uma solução de lactose a 40% (p/v) em 0,1 M de tampão acetato de sódio pH 4,5 a 45°C foi incubada com 6 U/mL de ?-galactosidase, a enzima converteu 30% da lactose em galactooligossacarídeos. Foi utilizado planejamento fatorial completo de 2 níveis para estudar o efeito da enzima (4,0 e 8,0 U/mL), pH (5,0 e 7,0) e temperatura (35°C e 45°C) na formação enzimática de galactooligossacarídeos a partir da lactose. Uma diminuição da concentração de enzima e temperatura, e um aumento do valor de pH resultou uma maior produção de galactooligossacarídeos. O produto obtido em maior quantidade foi identificado com 4'galactosil-lactose por cromatografia líquida de alta eficiência === Abstract: Galactooligosaccharides are produced frem lactose by the action of B?-galactosidases which have transgalactosylation activity. They are non-digestible carbohydrates, which are resistant to gastrointestinal digestive enzymes and are fermented by bifidobacteria. The benefits of galactooligosaccharide ingestion arise from increased population of bifidobacteria in the colon which, by their antagonistic effect, suppress the activity of putrefactive bacteria and reduce the formation of toxic fermentation products. The strain of Scopulariopsis accumulated large amounts of the ??galactosidase by semi-solid fermentation and the enzyme was produced constitutively. The enzyme obtained was fractionated with ammonium sulphate, acetone and ethanol, the precipitation with ammonium sulphate showed better results. The enzymatic extract was biochemically characterized, showing an optimum pH of 4.5 and optimum temperature of 65°C, and the enzymatic stability was at pH 5.0 and 50°C. The enzyme showed transgalactosylation activity, when it was evaluated by paper chromatography. Extracellular ??galactosidase from Scopulariopsis sp was semi-purified. The enzyme was a semi-purified 13-fold with a yield of about 14%. The molecular weight of the enzyme was estimated to be about 98 KDa by gel filtration. Some enzyme characteristics were determined using o-nitrophenyl-??galactopyranoside (ONPG) as substrate. The pH and temperature optimum of the activity were about 4.5 and 60°C, respectively. The enzyme was stable at 40°C for 24 hours and pH 5.0. The Km and Vmax values for ONPG were 2,28mM and 123llmoles/mUmin, respectively. The cations Fe+2, Fe+3 and Mn+2 activated the enzyme and N- bromosuccinimide inhibited activity. Transgalactosylation activity of the ??galactosidase was evaluated by high pressure liquid chromatography. The optimum temperature for galactosyltransferase activity was in the range of 35 to 45°C and the pH effect was minimal at high lactose concentration; the enzyme concentration for GOS synthesis was 4-6 U/mL. When 40% (w/v) lactose solution (in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 4.5, 45°C) was incubated with 6 U/mL of ??galactosidase, the enzyme converted 30% of the lactose in galactooligosaccharides. Two-Ievel full-factorial design experiments were designed to study effects of enzyme (4.0 and 8.0 U/mL), pH (5.0 and 7.0) and temperature (35°C e 45°C) on enzymatic formation of galactooligosaccharides from lactose. A decrease of enzyme concentration and temperature and an increase of pH value resulted in a higher galactooligosaccharides production. The major product was identified as 4'galactosyl-lactose by high performance liquid chromatography === Doutorado === Doutor em Ciência de Alimentos