Investigação das características físico-químicas da bactéria Xylella fastidiosa e seus biofilmes

• Main Author: Murillo Munar, Duber Marcel, 1984-
• Other Authors: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
• Format: Others
• Published: [s.n.] 2017
• Subjects: Bactérias; Biofilme; Adesão; Xylella fastidiosa; pH; Bacteria; Biofilms; Adhesion
• Online Access: MURILLO MUNAR, Duber Marcel. Investigação das características físico-químicas da bactéria Xylella fastidiosa e seus biofilmes. 2017. 92 f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/330326>. Acesso em: 2 set. 2018.; http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/330326

Orientador: Mônica Alonso Cotta === Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin === Made available in DSpace on 2018-09-02T14:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Munar_DuberMarcelMurillo_D.pdf: 4529701 bytes, checksum: 857481ff034498f82f42ab7dc98536b3 (MD5) Previous issue date: 2017 === Resumo: Neste trabalho estudamos características físico-químicas nos diferentes estágios de formação de biofilmes, principalmente no estágio inicial da adesão de bactérias planctônicas em superfícies. Usamos como modelo a bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa, que vive exclusivamente no xilema de diversas plantas lenhosas e é transmitido por diferentes insetos da ordem Hemíptera. As amostras analisadas neste estudo foram todas cultivadas sobre superfícies inorgânicas e após diferentes tempos de cultivo foram lavadas e secas antes de serem analisadas. Para estudar o processo integral de formação de biofilmes, examinamos amostras cultivadas sobre superfícies de vidro e Silício recoberto com ouro, em um meio de cultura complexo, chamado Periwinkle wilt. Através de técnicas como citoquímica, imunomarcação, microscopia e espectroscopia, analisamos os elementos produzidos pelas bactérias ou presentes na membrana celular durante cada estágio da formação de biofilmes. Conseguimos identificar espaço-temporalmente a aparição de pili, vesículas e três tipos diferentes de sustâncias poliméricas extracelulares, assim como algumas moléculas específicas que compõem estes elementos. Posteriormente, focalizamos nossos esforços no processo de adesão inicial em superfícies. Estudaram-se os três principais componentes envolvidos neste processo: adesinas, meio líquido e superfície. Primeiramente, se analisaram amostras de bactérias aderidas em superfícies de Silício. Nestas amostras aplicamos diferentes reagentes com a finalidade de investigar que tipo de ligação química está presente na interface adesina-superfície. Determinou-se que uma das ligações presentes nesta interface é a ligação glicosídica e que provavelmente está relacionada com as moléculas de lipopolissacarídeo localizadas na membrana bacteriana. A complexidade do meio de cultura fez que o estudo dos seus componentes fosse o elemento mais complicado de analisar. Inicialmente, deveram-se procurar as condições mínimas nas quais as bactérias sobrevivem, porém não conseguem aderir em superfícies. Assim, um meio de cultura complexo e definido, chamado Xylella fastidiosa Medium, foi modificado eliminando as componentes não relacionadas diretamente com a adesão bacteriana. Logo, adicionamos sistematicamente diferentes tipos de moléculas e/ou íons no meio de cultura simplificado identificando as condições que favorecem o processo de adesão. Encontramos uma dependência da adesão bacteriana com o pH do meio e a presença de cátions bivalentes com baixa energia de ionização. Como último parâmetro, estudamos a participação da superfície neste processo. Neste caso, além das superfícies de Silício, também usamos superfícies de Fosfeto de Índio para estudar o processo de adesão como função do pH do meio de cultura. A adesão nestas superfícies só apresentou diferenças significativas em um intervalo específico de pH. Analisando o conjunto de evidências obtidas em nossos experimentos, conseguiu-se formular um modelo que descreve este fenômeno tendo em conta todos os parâmetros estudados. Descreve-se o processo de adesão como a interação entre concentrações de duas espécies de moléculas diferentes alusivas à adesina e à superfície. Sugerimos que o processo de adesão pode ser tratado como um mecanismo puramente físico-químico e não biológico, razão pela qual nosso modelo poderia ser em teoria extrapolado a qualquer tipo de superfície e qualquer tipo de bactéria === Abstract: In this work we study physico-chemical characteristics in the different stages of biofilm formation, particularly in the early stages of adhesion of planktonic bacteria to surfaces. We use as model the phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa, which lives exclusively in the xylem of several woody plants and is transmitted by different insects of the order Hemiptera. The samples analyzed in this study were all grown on inorganic surfaces and after different culture times were washed and dried before being analyzed. To study the entire biofilm formation process, we examined samples grown on glass and silicon covered with gold surfaces in a complex culture medium called Periwinkle wilt. Through techniques such as cytochemistry, immunostaining, microscopy and spectroscopy, we analyze the elements produced by the bacteria or present in the cell membrane during each stage of biofilm formation. We have been able to identify space-temporally the appearance of pili, vesicles and three different types of extracellular polymeric substances, as well as some specific molecules that compose these elements. Subsequently, we focused our efforts on the initial cell binding process on surfaces. The three main components that intervene in this process were studied: adhesins, liquid medium and surface. First, samples of bacteria adhered to silicon surfaces were analyzed. In these samples, we applied different reagents to investigate the type of chemical bond present at the adhesin-surface interface. It has been determined that one of the bonds present at this interface is the glycosidic bond, which is probably related to the lipopolysaccharide molecules located in the bacterial membrane. The complexity of the culture medium made the study of its components the most complicated element to analyze. Initially, it was necessary to look for the minimum conditions in which the bacteria survive, but they cannot adhere to surfaces. Thus, a complex and defined culture medium, called Xylella fastidiosa Medium, was modified eliminating components not directly related to bacterial adhesion. Then, we systematically add different types of molecules and / or ions in the simplified culture medium, identifying the conditions that favor the adhesion process. We found a dependence of bacterial adhesion with the pH of the medium and the presence of bivalent cations with low ionization energy. As a final parameter, we studied the participation of the surface in this process. In this case, in addition to the Silicon surfaces, we also used Indium Phosphide surfaces to study the adhesion process as a function of the pH of the culture medium. Adhesion on these surfaces only showed significant differences over a specific pH range. Analyzing the set of evidences obtained in our experiments, we were able to formulate a model that describes this phenomenon taking into account all the parameters studied. The adhesion process is described as the interaction between concentrations of two different species of molecules alluding to adhesin and to the surface. We suggest that the adhesion process can be treated as a purely physico-chemical and non-biological mechanism, so that our model could in theory be extrapolated to any type of surface and any type of bacteria === Doutorado === Física === Doutor em Ciências === 1060584 === 2010/51748-7 === 479486/2012-3 === CAPES === FAPESP === CNPQ