Estratégias para viabilizar o uso de sêmen congelado na inseminação artificial cervical de ovinos

• Main Author: Casali, Renata
• Other Authors: Mezzalira, Alceu
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade do Estado de Santa Catarina 2016
• Subjects: criopreservação; pressão negativa; plasma seminal; FIV heteróloga; inseminação cervical; cryopreservation; negative pressure; seminal plasma; heterologous IVF; cervical insemination; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
• Online Access: http://tede.udesc.br/handle/handle/907

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA122.pdf: 692452 bytes, checksum: e25e927c8d8beb4236a0bb259e17524a (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Oxidative stress and premature sperm capacitation, generated during cryopreservation of ram semen, reduces their viability, especially after cervical insemination. The use of seminal plasma (SP) and negative pressure have produced protection and the reversion of such damages. Two experiments evaluated these potential enhancers of cryotolerance, and a third experiment compared 2 methods of cervical AI. In experiment 1 ram semen was subjected to the treatments: (TC) control or negative pressure of 200mBar (P200); 500mBar (P500) and 800mBar (P800). In experiment 2, the PS from rams, stallions and bulls was lyophilized (L) and its protein measured. From each SP 600μg of protein per mL was aded to the freezing diluent used, compounding the experimental groups: control (TC), ovine PS (PSLO), bovine PS (PSLB) and equine PS (PSLE). Experiment 3 evaluated 2 methods of AI, the superficial cervical AI (G1), and deep intrauterine or cervical AI with clamping the vaginal fornix (G2). The in vitro data were subjected to ANOVA and test T, and the pregnancy rate to the chi square test, all with 5% significance level. In the experiment 1 higher progressive motility (PM) was observed in TC (49%) compared to P200 (40.9%), P500 (38.9%) and P800 (38.9%) treatments. In PM during the test the thermal resistance (TTR), MP after percoll (PP), acrosome integrity (IAC), IAPP and membrane integrity (MI), there was no difference between the groups. In cleavage rate P800 (34.5%) was less than P200 (51.2%) and P500 (50.9%) did not differ from the control (44.3%). In conclusion the P500 is the most appropriate for use in ram semen cryopreservation, enabling high rates of cleavage after heterologous IVF, maintain membrane integrity. Experiment 2 evaluated MP, MPPP and cleavage rate after heterologous IVF in all groups, with the best group compared with the control in: CASA system; acrossoma integrity (FITC-PSA), membrane stability (M540), chromatin integrity (acridine orange), apoptosis (annexin) and potential of mitochondria (Mitotracker). Also the PSLE showed higher cleavage rate (71.37%), indicating a greater ability to oocyte penetration. The PSLE showed higher VCL (PC-163.5μm/s, PSLE-186.2μm/s) and ALH (PC9μm PSLE-8.2μm) in CASA evaluation, compared to control. In flow cytometry the annexin test revealed a greater amount of non-apoptotic viable cells in PSLE (38.9%), compared to TC (32.1%). In experiment 3 there was no difference in pregnancy rates after superficial (33.3%) or deep and intrauterine (52.2%) IA, possibly due to the reduced number of animals used === O estresse oxidativo e a precoce capacitação espermática, gerados na criopreservação do sêmen ovino, reduzem sua viabilidade, principalmente na inseminação cervical. O uso de plasma seminal (PS) e a pressão negativa têm produzido a proteção e reversão desses danos. Dois experimentos avaliaram esses potenciais melhoradores da criotolerância, e um terceiro avaliou dois métodos de IA cervical. No experimento 1 o sêmen ovino foi submetido aos tratamentos: controle (TC), pressão de 200mBar (P200); 500mBar (P500) e 800mBar (P800). No experimento 2 o PS de carneiros, garanhões e touros foi liofilizado (L) e sua proteína dosada. De cada PS, o equivalente a 600μg de proteína por mL, foi adicionado ao diluente de congelamento, compondo os grupos experimentais: controle (TC), PS ovino (PSLO), PS bovino (PSLB) e PS equino (PSLE). O experimento 3 avaliou 2 métodos de IA, a cervical superficial (G1) e a cervical profunda com pinçamento do fundo de saco vaginal (G2). Os dados in vitro foram submetidos a análise de variância e teste T, e a taxa de prenhez ao chi-quadrado, todos com significância de 5%. No experimento 1, maior motilidade progressiva (MP) foi observada no TC (49%) frente aos tratamentos P200 (40,9%), P500 (38,9%) e P800 (38,9%). Na MP durante o teste de termo resistência (TTR), MP após percoll (PP), integridade de acrossoma (IAC), IACPP, integridade de membrana (IM) e IMPP, não houve diferença entre os grupos. Na clivagem P800 (34,5%) foi inferior a P200 (51,2%) e P500 (50,9%), não diferindo do controle (44,3%). Conclui-se que a P500 é a mais adequada para uso com sêmen ovino, não reduzindo a viabilidade após o congelamento e proporcionando elevada taxa de clivagem após FIV heteróloga. O experimento 2 avaliou MP, MPPP e clivagem após FIV heteróloga de todos os grupos, sendo o melhor grupo comparado ao controle através de: sistema CASA, integridade de acrossoma (FITC-PSA), estabilidade de membrana (M540); integridade de cromatina (acridina orange); apoptose (anexina) e potencial de mitocôndria (mitotracker). O PSLE apresentou a maior taxa de clivagem (71,37%), evidenciando sua maior capacidade de penetração nos oócitos. Observou-se superioridade do PSLE nosparâmetros VCL (PC-163,5μm/s, PSLE-186,2μm/s) e ALH (PC-9μm, PSLE- 8,2μm) do CASA, em relação ao controle. Na citometria de fluxo, o teste da anexina revelou maior quantidade de células viáveis não apoptóticas com o PSLE (38,9%) em relação ao TC (32,1%). No experimento 3 não houve diferença na prenhez após IA superficial (33,3%) e profunda (G2 52,2%), possivelmente devido ao número reduzido de animais