Clonagem, superexpress?o, purifica??o e caracteriza??o da prote?na recombinante humana fator estimulador de col?nias de granul?citos

• Main Author: Vanz, Ana Let?cia de Souza
• Other Authors: Basso, Luiz Augusto
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul 2015
• Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; PROTE?NAS; C?LULAS; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
• Online Access: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5309

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 399966.pdf: 2182806 bytes, checksum: b7ae0dc782e83e28c95813d364f5ef3b (MD5) Previous issue date: 2008-03-27 === O fator estimulador de col?nias de granul?citos (G-CSF) ? uma citocina hematopoi?tica que age sobre a linhagem de neutr?filos promovendo prolifera??o e diferencia??o de seus precursores e ativa??o dos neutr?filos maduros. O G-CSF ? uma prote?na com 18,8 kDa, constitu?da por 174 amino?cidos possuindo duas pontes dissulfeto intra-moleculares e uma ciste?na livre no res?duo 17. Este biof?rmaco tem sido empregado com sucesso em pacientes com c?ncer que recebem altas doses de quimioterapia. Al?m disso, tamb?m tem sido usado como tratamento ou profilaticamente a fim de refor?ar o sistema imune em pacientes com HIV, pneumonia, pacientes diab?ticos com infec??es nos p?s, leucemia e neutropenia febril. Em fun??o desta ampla aplica??o cl?nica, hG-CSF recombinante tem sido produzido por engenharia gen?tica em Escherichia coli e foi aprovado para uso em neutropenia provocada por quimioterapia pelo FDA em 1991. Filgrastima (nome gen?rico do G-CSF) teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo das ind?strias farmac?uticas. Atualmente, o Brasil ? totalmente dependente da importa??o deste biof?rmaco. Logo, o objetivo deste estudo ? desenvolver uma metodologia para a posterior produ??o de uma Filgrastima nacional. Neste trabalho, o gene para hG-CSF foi constru?do por PCR, clonado no vetor de express?o pET23a(+), usando as enzimas de restri??o NdeI e BamHI. Os testes de superexpress?o foram realizados em diferentes cepas de E. coli, mostrando a melhor condi??o de express?o na fra??o insol?vel na cepa BL21(DE3). Na tentativa de solubilizar os corpos de inclus?o e purificar a prote?na, in?meros protocolos foram testados. Por fim, foi descrito um eficiente protocolo de isolamento e solubiliza??o dos corpos de inclus?o por um processo de m?ltiplos passos de lavagem e um m?todo de purifica??o usando somente uma coluna cromatogr?fica de troca cati?nica. A identidade da prote?na foi confirmada por seq?enciamento N-terminal e Western blotting. A caracteriza??o do rhG-CSF homog?neo, atrav?s de SEC-HPLC e RP-HPLC, mostrou resultados similares aos do padr?o internacional. O teste de atividade biol?gica, in vivo, demonstrou que o rhG-CSF produzido tem potencial equivalente ao padr?o internacional utilizado. A prote?na foi produzida por um processo simples e econ?mico, sendo de extrema import?ncia em um processo industrial, podendo trazer benef?cios para a sa?de da popula??o.