Estudos da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase por EPR convencional e da estrutura dinâmica de biomembranas por EPR pulsada bidimensional

• Main Author: Antônio José da Costa Filho
• Other Authors: Otaciro Rangel Nascimento
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2001
• Subjects: Centrose de ferro; Dioxigenases; Modelos de membranas; Ressonância RPE; RPE pulsado; Dioxygenases; EPR; Iron centers; Model membranes; Pulsed EPR
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76131/tde-06062007-181913/

Neste trabalho, usamos a técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica em seu modo convencional para o estudo da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase e em seu modo pulsado para o estudo da estrutura dinâmica de biomembranas. Clorocatecol 1,2-dioxigenase é uma enzima que catalisa a clivagem de estruturas aromáticas, como a do clorocatecol, via a a ativação e incorporação de uma molécula de oxigênio e que possui em seu sítio ativo um íon Fe(III). Nossos resultados de CD e atividade enzimática mostram o intervalo de temperaturas entre 20-25 ºC como aquele no qual a enzima apresenta atividade máxima. A maior contribuição para sua estrutura secundária vem de folhas β anti-paralela. A quantificação do número de spin feita por EPR indicou a presença de um íon Fe(III) por molécula de CCD, estando esse íon em estado de spin alto e simetria rômbica, como se depreende da linha estreita em g=4,3. Os parâmetros de desdobramentos de campo zero foram determinados pela medida em função da temperatura da linha em g=4,3, fornecendo λ=E/D=1/3 e D=(1,3±0,2) cm -1. O gráfico de Scatchard construído a partir dos espectros de EPR quando da titulação da enzima com o substrato catecol indicou a presença de um único sítio ligante de catecol, em acordo com a quantificação anterior do metal, e cuja constante de afinidade enzima-substrato é k=(2,7±0,1)x10-6 M. No que tange a EPR pulsado, foram utilizadas as chamadas técnicas modernas de EPR, com ênfase em 2D-ELDOR, para a investigação de diversos aspectos em membranas de interesse biológico. Primeiramente, investigamos a diferenciação entre a fase de líquido ordenado (Lo) e a de líquido cristalino (Lc) em membranas modelo de lipídio puro e lipídio/colesterol (1/1) contendo diferentes marcadores de spin (16-PC, CSL e DPPTC). Aí mostramos que é possível distinguir-se diferentes fases lipídicas apenas por simples inspeção visual dos espectros de 2D-ELDOR de um determinado marcador de spin incorporado à membrana. Além disso, realizamos simulações através do pacote de programas NLSPMC e determinamos as diferenças quantitativas entre as fases lipídicas: o estado de líquido ordenado apresenta maior fluidez e ordenamento na região das cadeias acílicas, ao passo que, na região da cabeça polar, mostra menor ordenamento. Em seguida, estudamos o efeito da presença de colesterol em alta concentração sobre o comportamento da membrana como função da temperatura. Nesse caso, o colesterol atua de maneira a manter a membrana em uma fase altamente ordenada e fluída dentro do intervalo de temperaturas medido, abolindo a transição gel-Lc do lipídio DPPC. Uma tentativa de aplicação de nossa metodologia ao estudo de membranas biológicas foi feita ao estudarmos membranas bleb que são ricas em colesterol. Estas mostram comportamento semelhante àquele observado para as membranas modelo com alta concentração de colesterol, um indicativo da existência de domínios Lo naquelas membranas biológicas. Por fim, estudamos o efeito da presença do peptídeo Gramicidina A\' (GA) sobre a estrutura da membrana de DPPC. Os resultados de 2DELDOR mostram claramente a presença de duas populações de lipídios (\"boundary\" e \"bulk\"). As simulações desses espectros foram as primeiras feitas com espectros contendo duas componentes e com os dados nas formas Sc- e Secsy. Essas mostram que os lipídios \"bulk\" são pouco afetados pela presença de moléculas de GA, ao passo que os lipídios \"boundary\" têm suas cadeias acílicas dobradas na porção terminal em torno das moléculas de GA, mecanismo que suporta a formação de domínios em fase HII na membrana. === In this work, EPR-CW and 2D-FT-EPR are used to study the enzyme chlorocatechol 1,2-dioxygenase and the dynamic structure of biological relevant membranes, respectively. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase (CCD) is a non-heme Fe(lIl) enzyme that catalyses the ring cleavage of aromatic compounds like chlorocatechol. The structure stability as a function of the temperature was determined via circular dichroism and catalytic activity assays. The enzyme has its maximum activity at 20-25 ºC. The main contribution to its secondary structure comes from antiparallel Β sheets. The iron content was determined by EPR measurements, indicating the presence of one Fe(llI) per molecule. The Fe(III) ion shows a very narrow line at g=4.3 indicating a high spin state in a rhombic symmetry with λ=E/D=1/3 and D=(1,3±0,2) cm -1. The Scatchard plot based on EPR spectra suggests the existence of one site for substrate binding with a binding constant k=(2,7±0,1)x10-6 M. As for 2D-FT-EPR, the so-called modem EPR techniques, like 2D-ELDOR, were used to investigate several aspects of biologically relevant membranes. Firstly, we determined the differences between the liquid-ordered (Lo) and the liquid-crystalline (Lc) phases in model membranes of pure lipid and of lipid/cholesterol (1/1) mixtures containing different spin labels (16-PC, CSL, and DPPTC). In this case, we show how 2D-ELDOR makes possible the differentiation between Lo and Lc phases just by a pattern recognition scheme. We also performed simulations of those spectra and the results are: the Lo phase shows higher fluidity and ordering in the acyl chain region, whereas it shows lower ordering in the headgroup polar region. After that the membrane behaviour as s function of temperature was studied. We showed that cholesterol maintains the membrane in a highly ordered and fluid structure over the entire range of temperatures, abolishing the gel-Lc phase transition of the lipid DPPC. The biological membrane bleb was the first attempt to apply our methodology to real membranes. The 2D-ELDOR results for bleb membranes indicate the existence of Lo domains in the structure of those membranes. Finally, we studied the effects of the peptide Gramicidin A\' (GA) on the lipid organization of DPPC membranes. The 2D-ELDOR results show very clear two-component spectra (assigned to bulk and ,boundary lipids), which were simulated by the NLSPMC programs. This is the first time that 2D-FT-EPR multi-component spectra are simulated using both the Sc- and Secsy formal. The simulations indicate that the GA molecules do not significantly affect the bulk lipid, whereas the boundary lipids present the end portion of their acyl chain bent towards the GA molecule. This mechanism is probably responsible for the local formation of the HII phase in the membranes.