Croton floribundus e Croton urucurana: fontes de flavonoides e enzimas para a biocatálise de acilação

• Main Author: Jocimar Oliani
• Other Authors: Maria Luiza Faria Salatino
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2018
• Subjects: Acilação enzimática.; Croton floribundus; Croton urucurana; Flavonoides; Tilirosideo; Enzymatic acylation; Flavonoids; Tiliroside
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41132/tde-19092018-161107/

Croton é o segundo maior gênero de Euphorbiaceae, com aproximadamente 1.300 espécies, sendo 300 delas existentes no Brasil em diversos biomas. Várias espécies apresentam um característico látex vermelho-sangue, chamado \"sangue-de-dragão\", sendo usadas mundialmente na medicina tradicional. Estudos químicos indicam a presença de múltiplas classes de compostos, sendo as principais: diterpenos (clerodanos, labdanos, kauranos e traquilobanos), óleos voláteis, esteroides e triterpenoides, alcaloides, proantocianidinas e flavonoides. Estes últimos são metabólitos secundários com grande variedade estrutural, possuindo atividades biológicas reconhecidas e de potencial interesse medicinal. Croton floribundus Spreng. e Croton urucurana Baill., por apresentarem várias atividades biológicas de interesse medicinal, são utilizadas na medicina tradicional. Entretanto, poucos estudos têm sido desenvolvidos no sentido de se conhecer melhor aquela classe de substâncias fenólicas. Um dos objetivos deste trabalho corresponde ao isolamento e identificação de flavonoides de folhas de Croton floribundus e Croton urucurana. O material pulverizado foi extraído por refluxo com metanol 80% e concentrado. O extrato seco foi tratado com tolueno e diclorometano. A fase metanólica resultante foi fracionada e subfracionada por meio de cromatografia em coluna de PVPP e Sephadex LH-20, e cromatografia em papel. Depois de fracionadas, as amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e os compostos identificados por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H) e carbono (13C) ou por CLAE com co-injeção de amostras autênticas. Em ambas as espécies foi identificado o flavonoide acilado tilirosídeo (5). Este parece ser um flavonoide característico do gênero. É um derivado acilado de kaempferol, isolado de um grande número de espécies de Croton. Em C.floribundus foram identificados três triglicosídeos: alcesefolisídeo (1), mauritianina (2), e isoramnetina-3-O-(2,6-di-ramnosil)-galactosídeo (3). Foram identificados também: quercetina-3-O-glucosídeo (4), helicrisosídeo-3\'-metil-éter (6), kaempferol (7), isoramnetina (8) 3-O-metil-kaempferol (9) e 3-O-metil isoramnetina (10). Em C.urucurana, foram identificados: orientina (11), rutina (12), vitexina (13), quercetina-7-O-ramnosídeo (14), ramnetina-3-O-ramnosídeo (15) e quercetina (16). Os flavonoides 1, 3, 14 mostraram-se inéditos, tanto para o gênero, quanto para a família. O flavonoide 15 foi inédito para o gênero, tendo sido encontrado na família, porém, na subfamília Euphorbioideae. Com a detecção do tilirosídeo, foi verificada a possibilidade de se utilizar os extratos proteicos de folhas jovens dessas duas espécies para acilar enzimaticamente flavonoides de interesse, pois estudos na literatura indicam que a acilação pode aumentar a estabilidade e biodisponibilidade de flavonoides, e também melhorar suas atividades biológicas. Para isso, folhas jovens foram coletadas e mantidas em N2 líquido, trituradas e extraídas com tampão de extração. O extrato obtido foi concentrado, sua concentração proteica foi determinada e, posteriormente, foi utilizado para acilar os substratos quercetina-3-O-glucosídeo, kaempferol-3-O-glucosídeo, quercetina-3-O-galactosídeo e quercetagetina-7-O-glucosídeo. p-Cumaroil-CoA e uma mistura de ácido p-cumárico e Coenzima A, foram utilizados como agentes acilantes. Foi verificado que o rendimento do extrato proteico de C.floribundus foi menor que o de C.urucurana. Enquanto o extrato de C.urucurana acilou os substratos glicosilados na posição 3, (kaemferol-3-O-glucosídeo, quercetina-3-O-glucosídeo e quercetina-3-Ogalactosídeo), não acilou o mono-glicosilado na posição 7 (quercetagetina-7-Oglucosídeo), indicando que as aciltransferases dessa espécie são regiosseletivas quanto à posição do resíduo de açúcar. Também demonstrou capacidade de acilação usando como agentes acilantes p-cumaroil-CoA e a combinação ácido p-cumárico + CoA + ATP. O extrato proteico de C.floribundus, talvez por ter apresentado um menor rendimento de extração, acilou apenas o kaempferol-3-O-glucosídeo, resultando no tilirosídeo, o flavonoide acilado característico do gênero === Croton is the second largest genus of Euphorbiaceae, with approximately 1,300 species, 300 among them native from Brazilian biomes. Several species of the genus, used worldly in traditional medicine, possess a characteristic blood colored latex, called \"dragon\'s blood\". Chemical studies about Croton species have uncovered multiple classes of secondary metabolites, such as diterpenes (clerodanes, labdanes, kauranes and trachylobanes), volatile oils, steroids and triterpenoids, alkaloids, proanthocyanidins and flavonoids. The latter are secondary metabolites with high structural diversity and recognized as having biological activities with medicinal potential. Croton floribundus Spreng. and C. urucurana Baill. have shown several medicinally promising biological activities and are used in traditional medicine. However, few investigations have been performed aiming the flavonoid chemistry of any of the two species. One of the objectives of the present study is the isolation and identification of flavonoids from leaves of C. floribundus and C. urucurana. Powdered material from both species was extracted by reflux with 80% methanol. The dry extracts were treated with toluene and dichloromethane, lyophilized and solubilized in methanol. The methanol solution was analyzed by polyvinylpolypyrrolidone column chromatography (PVPP-CC). The fractions obtained were further analyzed by PVPP-CC, Sephadex LH-20 column chromatography and paper chromatography. The fractions and isolated compounds obtained were analyzed by HPLC. Isolated compounds were identified by 1H and 13C NMR and HPLC co-chromatography with authentic samples. The acylated flavonol tiliroside (5) was obtained from extracts of both species. It seems to be a characteristic marker of the genus, having been reported for a high number of Croton species. From the leaf extract of C. floribundus three triglycosides were obtained in the present work: alcesefoliside (1), mauritianin (2) and isorhamnetin-3-O-(2,6-dirhamnosyl)-galactoside (3). Other glycosides identified were quercetin-3-O-glucoside (4), 3\'-helichrysoside-3-O-methyl ether (6), kaempferol (7), isorhamnetin (8), 3-O-methyl-kaempferol (9) and 3-O-methyl-isorhamnetin (10). The following compounds were obtained from C. urucurana: orientin (11), rutin (12), vitexin (13), quercetin-7-O-rhamnoside (14), rhamnetin-3-O-rhamnoside (15) and quercetin (16). Flavonoids 1, 3 and 14 are new regarding genus Croton and family Euphorbiaceae. Flavonoid 15 was previously found in subfamily Euphorbioideae and is now reported for the first time in Croton. Taking into account the detection of tiliroside in the material analyzed, and that acylation increases both stability and bioavailability of flavonoids, while enhancing their biological activity, an approach was planned to use protein extracts of young leaves of both species aiming the enzymatic acylation of several flavonoids. Young leaves were maintained in liquid N2, ground and treated with extraction buffer. The extract obtained was concentrated and mixed with p-coumaroyl-CoA and a mix of p-coumaric acid and Coenzyme A. The extract was used in assays aiming the acylation of quercetin-3-O-glucoside, kaempferol-3-O-glucoside, quercetin-3-O-galactoside and quercetagetin-7- O-glucoside. The concentration of the protein extract from C. floribundus was lower than that of C. urucurana. The extract from C. urucurana acylated the 3-O-glycosilated substrata kaempferol-glucoside, quercetin-glucoside and quercetin-galactoside, but was ineffective toward quercetagetin-7-O-glucoside. These results suggest that acyltransferases in the extract are regioselective about the position of attachment of the sugar moiety. They were shown to be effective using either p-coumaroyl or the combination p-coumaroyl-CoA + ATP. C. floribundus protein extract acylated only kaempferol-3-O-glucoside, yielding tiliroside, the characteristic acylated flavonoid of Croton