| Summary: | O papilomavírus (PV) constitui um grupo diverso de pequenos oncovírus não-envelopados e com genoma DNA fita dupla circular, classificados na família Papillomaviridae. Em bovinos são descritos 10 tipos de papilomavírus bovino (BPV) que, com base na identidade de nucleotídeos da proteína estrutural L1, estão distribuídos nos gêneros Deltapapillomavirus (BPV-1 e -2), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 e -8), Xipapillomavirus (BPV-3, -4, -6, -9 e -10) e em um gênero ainda não definido (BPV-7). A infecção por diversos tipos de BPV tem sido relacionada a diferentes quadros clínicos em bovinos, destacando-se a papilomatose cutânea. A identificação dos tipos virais que determinam sinais clínicos e daqueles que resultam em infecções subclínicas tem sido realizada por meio da técnica da PCR, tanto em bovinos quanto em seres humanos. Como a L1 é a proteína mais conservada entre os PVs, foram desenvolvidos oligonucleotídeos iniciadores (primers) consensuais e genéricos, que apresentam alta identidade de nucleotídeos com seqüências conservadas da ORF L1. Esses sistemas de PCR têm sido utilizados para detectar uma grande variedade de tipos virais em amostras clínicas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer o posicionamento filogenético de um provável novo tipo de BPV (BPV/BR-UEL2), identificado no Brasil, por meio da caracterização molecular de seu gene L1. O DNA do BPV/BR-UEL2 foi isolado a partir de um papiloma cutâneo, localizado na região axilar de uma vaca leiteira do Estado do Paraná. Como a análise anterior, envolvendo a seqüência de 475 pb obtida pela PCR utilizando os primers FAP59/FAP64, havia indicado que o BPV/BR-UEL2 era mais relacionado ao BPV tipo 4, os alinhamentos das regiões genômicas L2, L1 e LCR de alguns representantes do gênero Xipapillomavirus (BPV-3, -4 e -6) foram utilizados na elaboração de primers genéricos. Adicionalmente, o par de primers FAP também foi empregado, tanto na sua forma original quanto em combinações com os primers desenhados para este estudo. O primeiro segmento do gene L1 pôde ser obtido por meio de um sistema semi-nested (SN-PCR) empregando na primeira etapa de amplificação os primers L2Bf/FAP64, e o par de primers L2Bf/L1Br na segunda etapa de amplificação, resultando em um produto de PCR de 435 pb. A amplificação das regiões remanescentes do mesmo gene foi obtida a partir dos primers FAP59/FAP64 (475 pb) e L1Bf/LCRBr (1128 pb). Os referidos produtos de PCR foram posteriormente submetidos à clonagem e seqüenciamento. A análise filogenética envolvendo seqüências completas da ORF L1 revelou que a amostra BPV/BR-UEL2 estava relacionada aos tipos de BPV agrupados no gênero Xipapillomavirus. O provável novo tipo de BPV analisado neste estudo apresentou maior similaridade (78%) com a seqüência de nucleotídeos do gene L1 do BPV tipo 4, o que sugere a sua classificação no gênero Xipapillomavirus. No Brasil, apesar do caráter endêmico das infecções pelo BPV, a identificação dos tipos de BPV em rebanhos bovinos ainda é esporádica. Recentemente, a utilização do par de primers FAP59/FAP64 permitiu a identificação de quatro prováveis novos tipos virais, ainda não descritos no mundo, e provenientes de bovinos do estado do Paraná. No presente estudo, o posicionamento filogenético de um destes tipos virais, detectado a partir de uma lesão cutânea de uma vaca leiteira, foi determinado. A realização de estudos complementares envolvendo a epidemiologia molecular das infecções pelo BPV, tanto em rebanhos bovinos brasileiros quanto de diversas regiões geográficas ao redor do mundo, poderiam indicar a prevalência e checar a associação deste isolado com lesões cutâneas. === Papillomaviruses (PVs) comprise a highly diverse group of non-enveloped oncovirus classified in Papillomaviridae family, whose genome consists of a circular double-stranded DNA molecule. Depending on nucleotide identity presented in structural protein L1, 10 types of bovine papillomavirus (BPV) are described in cattle, being each of them located in genera Deltapapillomavirus (BPV-1 and -2), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 and -8), Xipapillomavirus (BPV-3, -4, -6, -9, and -10), and an yet assigned genus (BPV-7). Infection by diverse BPV types has been associated with different clinical outcomes in cattle, being the cutaneous papillomatosis considered as an important cause of economic losses. The identification of viral types involved with either clinical manifestations or assintomatic infections, has been mainly performed by PCR assay, both in cattle and humans. Since the L1 is considered as the most conserved protein in PVs, consensus and degenerate primers, manifesting a high degree of nucleotide identity with sequences in L1 ORF, has been designed to detect a broad range of viral types in clinical specimens. The aim of the current study is to state the phylogenetic position of a previously identified putative new BPV type (BPV/BR-UEL2) detected in Paraná state, Brazil, through the molecular characterization of its L1 gene. The BPV/BR-UEL2 was isolated from a papilloma located in the axillary region of a dairy cow. As the previous FAP sequence analysis had revealed our isolate as closest related to BPV type 4, alignments of L1, L2, LCR genomic regions of some Xipapillomavirus representatives (BPV-3, -4, and -6), were used on design of degenerate primers. In addition, the previously described FAP primer pair was also employed both in the original form as in combination with the designed primers. The first L1 segment of the Brazilian isolate could be achieved by a semi-nested PCR system (SN-PCR) employing L2Bf/FAP64 primers in the first round, and L2Bf/L1Br primer pair in the second round, which yielded an amplicon of 435 bp. The use of the FAP59/FAP64 (475 bp) and L1Bf/LCRBr (1128 bp) primer sets allowed the amplification of the remaining portions of the same gene. These three overlapping amplicons obtained from the L1 ORF were submitted to cloning and then sequenced. Phylogenetic analysis with complete L1 ORF sequences revealed the BPV/BR-UEL2 isolate as related with BPV types held in Xipapillomavirus genus, displaying the highest L1 nucleotide sequence similarity with BPV type 4 (78%), what suggests its classification in the Xipapillomavirus genus. In Brazil, despite the relatively common occurrence of BPV infections, the identification of BPV types in cattle herds is still sporadic. Recently, the use of the FAP59/FAP64 primer pair enabled the identification of four putative new BPV types, not yet described around the world, from cattle from Parana state. In the present study, we determine the phylogenetic position of one of these viral types, which was detected from a cutaneous lesion of a dairy cow. The realization of further studies involving the molecular epidemiology of BPV infections, in Brazilian cattle herds as much in diverse geographical areas around the world, could indicate its prevalence throughout the cattle as well as check its association with cutaneous lesions.
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