PCR multiplex para detecção de Salmonella spp. e diferenciação de S. Enteritidis e S. Typhimurium em carne de frango

• Main Author: Erika Kushikawa Saeki
• Other Authors: Tereza Cristina Rocha Moreira de Oliveira .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. 2011
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000170336

Salmonella enterica subespécie enterica sorovares Enteritidis e Typhimurium são importantes agentes causadores de infecções alimentares. Métodos de detecção simultânea destes sorovares podem contribuir para a adoção de medidas de prevenção destas doenças. A reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção individual ou simultânea (PCRm) dos sorovares Enteritidis e Typhimurium em alimentos já foram padronizados, no entanto, a maioria emprega o gene fliC como alvo para detecção do sorovar Typhimurium. A especificidade deste gene é questionável, pois também já foi descrito para S. Kentucky. Neste contexto, o objetivo desta pesquisa foi desenvolver um novo ensaio PCR multiplex (PCRm) para a detecção e diferenciação simultânea de Salmonella spp., S. Enteritidis e S. Typhimurium em carne de frango. O gene STM4492, que foi utilizado para diferenciar S. Typhimurium, nunca havia sido utilizado em ensaio multiplex para diferenciação desses sorovares. Os ensaios de PCRm revelaram elevada especificidade para S. Typhimurium com capacidade de diferenciá-lo dos 22 sorovares de Salmonella testados, incluindo S. Kentucky. Os pares de oligonucleotídeos Styinva-JHO-2 (gene invA) e ENT (gene sdf) empregados no ensaio para detecção de Salmonella spp. e S. Enteritidis mostraram-se também específicos. A sensibilidade do ensaio foi de 100% e a especificidade de 94,8%. O ensaio foi capaz de detectar 1 a 10 UFC/mL de S. Enteritidis e S. Typhimurium após 24 horas de enriquecimento não seletivo e extração do DNA com TZ e fervura sem purificação. A extração do DNA com TZ e fervura é adequada e, devido a sua simplicidade, pode ser utilizada na rotina laboratorial. O ensaio mPCR desenvolvido mostrou ser viável e apresentar sensibilidade satisfatória para a detecção de Salmonella spp. e a diferenciação dos sorovares Enteritidis e Typhimurium em carne de frango. Dada a importância dos surtos de salmonelose, o ensaio mPCR padronizado pode ser utilizado como ferramenta de triagem rápida em laboratórios de análise de alimentos e como técnica alternativa para a identificação específica dos sorovares Enteritidis e Typhimurium a partir de cepas isoladas pelo método convencional. === Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis and Typhimurium are important causes of foodborne illness. Methods for simultaneous detection of these serovars may contribute for the adoption of measures to prevent these diseases. The polymerase chain reaction (PCR) to detect individually or simultaneously the serovars Enteritidis and Typhimurium in foods have been standardized, however, the majority of assays employs the fliC gene as a target for detection of serovar Typhimurium. The specificity of that gene is questionable, as it has also been described for S. Kentucky. In this context, the aim of this study was to develop a new multiplex PCR assay (mPCR) for the simultaneous detection and differentiation of Salmonella spp., S. Enteritidis and S. Typhimurium in chicken meat. The gene STM4492, that was used to differentiate S. Typhimurium, has never been used in multiplex assay for differentiation of those serovars. The mPCR assays showed high specificity and differentiated S. Typhimurium from 22 Salmonella serovars tested, including S. Kentucky. The pairs of oligonucleotides Styinva-JHO-2 (gene InvA) and ENT (sdf gene), used in the assay for detection of Salmonella spp. and S. Enteritidis, were also specific. The assay sensitivity was 100% and specificity of 94.8%. The mPCR can detect 1 to 10 CFU / mL of S. Enteritidis and S. Typhimurium after 24 hours of non-selective enrichment and DNA extraction with TZ and boiling, without purification. The DNA extraction with TZ and boiling is adequate, and because of its simplicity, can be used in routine laboratory. The developed mPCR assay was adequate and showed satisfactory sensitivity for detection of Salmonella spp. and differentiation of serovars Typhimurium and Enteritidis in chicken meat. Given the importance of Salmonella outbreaks, the mPCR can be used as a screening tool for a rapid laboratory analysis of food and as an alternative technique for the identification of strains of S. Enteritidis and S. Typhimurium isolated from the conventional method.