Conjugação in vitro de Enterococcus sp. resistente à vancomicina

• Main Author: Márcia Regina Terra
• Other Authors: Márcia Cristina Furlaneto .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia. 2013
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000202255

O gênero Enterococcus tem grande importância na Microbiologia de Alimentos devido a sua utilização como probiótico e seu uso como cultura iniciadora. No entanto, tem emergido como importante patógeno de infecções nosocomiais. A resistência de Enterococcus à maioria dos antimicrobianos de escolha e também a vancomicina tem sido relatado como um problema de saúde mundial. Enterococcus possui à habilidade natural de adquirir resistência a diferentes antimicrobianos por meio de transferência horizontal de genes, principalmente pela obtenção de plasmídeos de resistência via processo conjugativo, que conferem a capacidade de expressar fenótipos de resistência a diversas drogas. Um dos principais genes de resistância a vancomicina detectados em Enterococcus é o gene vanA com isso o objetivo do presente estudo foi avaliar a transferência do gene vanA, via processo conjugativo, entre isolados de E. faecium e E. faecalis, em meio de cultura e em leite. No presente estudo foi determinado o perfil genotípico e fenotípico de 30 isolados de Enterococcus spp. por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) com os oligonucleotídeo iniciadores vanA, tetL, gelE e cpd e pela técnica de Concentração Inibitória Mínima(CIM). A transferência do gene vanA in vitro foi demonstrada em caldo Mueller Hinton e em leite reconstituído na razão de 1:1(doador: receptor), seguido de incubação a 37ºC, a 80 rpm, por 6 horas. A cada 2 horas 100μl do co-cultivo foi semeado em ágar Mueller Hinton contendo Tetraciclina (16μg/mL) e Vancomicina (32μg/mL), e as placas foram incubadas a 37ºC por 18 horas, com posterior contagem de UFC/mL. A frequência de transconjugantes foi obtida pela razão do número de transconjugantes pelo número de células doadoras utilizadas no co-cultivo. A estabilidade plasmidial e a confirmação dos transconjugantes foi realizada PCR com os oligonucleotídios citados acima. A mesma metodologia foi realizada com doador morto por aquecimento. A análise do perfil genotípico e fenotípico nos proporcionou formar 30 pares, sendo 10 isolados doadores e 3 isolados receptores. Foram obtidos transconjugantes do gene vanA em todos os pares e tempos testados. No experimento de conjugação do gene vanA em MH a maior frequência obtida foi de 5,5x105 e a menor foi de 0,3x105 UFC/mL, com duas horas de co-cultivo. Não obtivemos transconjugantes com a técnica doador morto, excluindo assim o processo de transformação como método de transferência do gene. Foi observado 100% de estabilidade com todos os pares. A eficiência de Enterococcus em transferir o gene vanA leva a disseminação deste gene de resistência o que pode resultar no aumento da frequência de Enterococcus spp. resistente à vancomicina, limitando cada vez mais as alternativas de terapêutica. === The genus Enterococcus is of great importance in Food Microbiology due to their use as probiotics and their use as starter culture. However, it has emerged as an important pathogen of nosocomial infections. The resistance of Enterococcus to most antimicrobials of choice and also to vancomycin has been reported as a global health problem. Enterococcus has the natural ability to acquire resistance to antimicrobials through horizontal gene transfer, especially by obtaining plasmids resistance via conjugative process, conferring the ability to express phenotypic resistance to many drugs. One of the key genes of vancomycin resistence detected in Enterococcus vanA gene is thus the aim of this study was to evaluate the transfer of the vanA gene, via conjugative process, among isolates of E. faecalis and E. faecium in culture medium and in milk. In the present study we determined the phenotypic and genotypic profile of 30 isolates of Enterococcus spp. by polymerase chain reaction (PCR) with oligonucleotide primers vanA, tetL, gelE and cpd and the technique of minimal inhibitory concentration (MIC). The vanA gene transfer in vitro was demonstrated in Mueller Hinton broth and milk reconstituted in a 1:1 ratio (donor: recipient), followed by incubation at 37 °C, 80 rpm for 6 hours. Every two hours 100 μl of the co-culture was seeded on Mueller Hinton agar containing tetracycline (16μg/mL) and vancomycin (32μg/mL), and the plates were incubated at 37 ° C for 18 hours, with subsequent counting of CFU / mL. The frequency of transconjugants was obtained by the ratio of the number of transconjugants by the number of donor cells used in co-cultivation. The plasmid stability and confirmation of transconjugants PCR was performed with oligonucleotides mentioned above. The same methodology was performed by heating dead donor. The analysis of phenotypic and genotypic profile form provided in 30 pairs, 10 donors and 3 isolates isolated receivers. Transconjugants were obtained of the vanA gene in all pairs and times tested. In the experiment conjugation of the vanA gene in MH the highest frequency obtained was 3,5 x10-5 and the lowest was 0,3 x10-5 CFU / mL, with two hours of co-cultivation. No transconjugants obtained with the technique dead donor, thereby excluding the transformation process as the method of gene transfer. It was observed 100 % stability for all pairs. The efficiency of gene transfer in Enterococcus leads to dissemination of the vanA resistance gene which can result in increased frequency of Enterococcus spp. vancomycin-resistant, limiting increasingly alternative therapy.