| Summary: | A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma zoonose causada por protozoários do gênero Leishmania. Os fármacos disponíveis para o tratamento da LTA apresentam: toxicidade, baixa eficiência e dificuldade de administração, tais fatores implicam na busca por terapias alternativas. Plantas do gênero Caryocar são encontradas no cerrado brasileiro e seus frutos são utilizados como alimento e na medicina popular. Estudos com diferentes extratos destas plantas demonstraram efeito anti-inflamatório, antifúngico, antibacteriano, analgésico, antineoplásico, imunomodulador, cicatrizante e leishmanicida. Entretanto, não existem estudos que tenham verificado o efeito de extratos provenientes da espécie C. coriaceum sobre protozoários Leishmania. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito dos extratos de C. coriaceum sobre Leishmania amazonensis. Para isso foram utilizados diferentes extratos, de acordo com a origem e o solvente utilizado, respectivamente: (1) polpa do fruto, etanol; (2) casca do fruto, etanol; (3) folha, acetato de etilo; (4) folha, metanol. Na triagem fitoquímica, realizada com o intuito de verificar a presença de alcalóides, catequinas, esteróides, fenóis, flavonóides, saponinas e taninos, foi verificado que os extratos 1 e 3 apresentaram todos os metabólitos investigados, enquanto no extrato 2 não foram verificados catequinas, e no extrato 3, catequinas e esteróides estavam ausentes. Quando quantificados os fenóis e flavonóides, observou-se que o extrato 2 era o mais abundante em fenóis, enquanto o extrato 3 se destacou pela maior quantidade de flavonóides. Para os ensaios biológicos, formas promastigotas de L. amazonensis foram mantidas em meio 199 e utilizadas em fase estacionária. O ensaio antipromastigota foi realizado através da contagem em câmara de Neubauer onde verificou-se que todos os extratos apresentaram efeito antileishmania após 24, 48 e 72h de tratamento. Este dado foi confirmado através de microscopia eletrônica de varredura (MEV), na qual foram observadas alterações morfológicas nos parasitos tratados com os diferentes extratos na concentração de 50 μg/mL. Ao caracterizar os mecanismos pelos quais os extratos induziram a morte do parasito, verificamos, por sonda catiônica (TMRE) que os tratamentos induziram despolarização mitocondrial e, por sonda H2DCFDA, que os extratos levaram a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) em promastigotas. De forma semelhante, foi verificado que os tratamentos provocaram danos na membrana plasmática, pela marcação com iodeto de propídio (IP) e a marcação com anexina V revelou que o tratamento induz a exposição à fosfatidilserina, eventos sugestivos de morte por processo apoptose-like tardio/ necrose. Em seguida, verificamos o efeito anti-amastigota dos extratos em macrófagos infectados com L. amazonensis. Primeiramente, observamos que o intervalo de concentrações não alterou a dos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c. Na sequência, os macrófagos foram infectados com os parasitos (1:5), e analisado o efeito nas formas amastigotas. Nossos resultados mostraram que o tratamento com os extratos foi capaz de reduzir o número de amastigotas por macrófago, macrófagos infectados e também a quantidade de parasitos viáveis recuperados. Adicionalmente, através do ensaio de CBA (cytometric bead array), verificamos que os extratos não foram capazes de modular os níveis das citocinas investigadas, nem a síntese dos mediadores microbicidas, óxido nítrico (NO) e ERO, analisados por ensaio de Griess e marcação com sonda fluorescente H2DCFDA, respectivamente. Com base nos dados obtidos, podemos inferir que extratos de diferentes partes da planta de C. coriaceum exercem efeito leishmanicida, atuando em formas promastigotas através de mecanismos apoptose-like tardios/necrose e em formas amastigotas de forma direta, ou seja, independente da ativação de macrófagos. === American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) is a zoonosis caused by protozoa of Leishmania genus. The drugs available for ACL treatment present toxicity, low efficiency and difficult administration; such factors imply the search for alternative therapies. Plants of the Caryocar genus are found in the Brazilian cerrado and its fruits are used as food and in folk medicine. Studies with different extracts from these plants demonstrated anti-inflammatory, antifungal, antibacterial, analgesic, antineoplastic, immunomodulatory, wound healing and leishmanicidal effects. However, there are no studies that have verified the effect of C. coriaceum extracts on Leishmania protozoa. In this sense, the objective of the present study was to investigate the effect of C. coriaceum extracts on Leishmania amazonensis. For this, different extracts were used, according to the origin and solvent used, respectively: (1) fruit pulp, ethanol; (2) fruit peel, ethanol; (3) leaf, ethyl acetate; (4) leaf, methanol. In the phytochemical screening carried out in order to verify the presence of alkaloids, catechins, steroids, phenols, flavonoids, saponins and tannins, it was verified that extracts 1 and 3 presented all the metabolites investigated, while in extract 2, catechins were not verified, and in extract 3, catechins and steroids were absent. When quantifying the phenols and flavonoids, it was observed that extract 2 was the most abundant in phenols, while extract 3 was highlighted by the greater amount of flavonoids. For the biological assays, promastigote forms of L. amazonensis were maintained in 199 medium and used in stationary phase. The antipromastigote assay was performed by counting in the Neubauer chamber where all extracts were found to have antileishmania effect after 24, 48 and 72 hours of treatment. This data was confirmed by scanning electron microscopy (SEM), in which morphological changes were observed in the parasites treated with the different extracts at the concentration of 50 μg/mL. For characterizing the mechanisms by which the extracts induced the death of the parasite, we verified by cationic probe (TMRE) that the treatments induced mitochondrial depolarization and, by H2DCFDA probe, that the extracts led to the production of reactive oxygen species (ROS) in promastigotes. Similarly, treatments were found to cause damage to the plasma membrane by propidium iodide (PI) labeling and annexin V staining revealed that the treatment induces exposure to phosphatidylserine, events suggestive of late apoptosis-like/ necrosis death. Then, we verified the anti-amastigote effect of the extracts in macrophages infected with L. amazonensis. First, we observed that the concentrations did not alter that of the peritoneal macrophages of BALB/c mice. Subsequently, macrophages were infected with the parasites (1:5), and the effect on the amastigote forms was analyzed. Our results showed that treatment with the extracts was able to reduce the number of infected macrophages, amastigotes by macrophage and also the amount of viable parasites recovered. Additionally, through the CBA (cytometric bead array) assay, we found that the extracts were not able to modulate investigated cytokine levels nor the synthesis of microbicidal mediators, nitric oxide (NO) and ROS, analyzed by Griess assay and labeling with H2DCFDA fluorescent probe, respectively. Based on the data obtained, we can infer that extracts from different parts of the C. coriaceum plant exert leishmanicidal effect, acting in promastigote forms through late apoptose-like/ necrosis mechanisms and in amastigote forms directly, that is, independent of the macrophages activation.
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