Desenvolvimento e padronização de uma reação de PCR multiplex para a genotipagem de protozoários patogênicos

• Main Author: Pereira, Elisa Cavalcante
• Other Authors: Levy, Claudia Masini D’Avila
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex; Técnicas de Genotipagem; Genoma de Protozoário; Tipagem de Sequências Multilocus; Filogenia
• Online Access: http://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/16041

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Rio de Janeiro, RJ, Brasil === De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), as Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs), como a doença de Chagas, tripanossomíase africana, entre outras, afetam cerca de 1 bilhão de pessoas no mundo. Apesar do impacto causado por estas doenças, as mesmas continuam sendo pouco estudadas. O reino Protista, ao qual os agentes etiológicos dessas doenças pertencem, incluem espécies de importância veterinária que causam muitas perdas para a indústria pecuária. Com os avanços da genética molecular, técnicas como a genotipagem estão sendo usado cada vez mais utilizadas para o estudo de protozoários parasitos. Genes ortólogos conservados em protozoários podem ser utilizados como loci para genotipagem desses protozoários, de modo a obter uma melhor caracterização interespecífica. Neste estudo, foram utilizadas técnicas de PCR singleplex e multiplex para a genotipagem de 16 espécies de protozoários de três diferentes gêneros: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (classe Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (filo Apicomplexa). Como metodologia de biologia molecular foram utilizados PCR e sequenciamento, bem como em bioinformática, onde foi utilizado filogenia molecular. Para esta finalidade, foram desenhados 39 pares de iniciadores degenerados e usados com o DNA genômico de espécies de protozoários de dois grupos: filo Apicomplexa e classe Kinetoplastea, em seguida, as reações de PCR foram realizadas a fim de padronizar as reações para um PCR multiplex. Além disso, os seguintes parasitos de importância para a saúde pública: T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum e P. Vivax, foram utilizados neste trabalho A partir dos 39 pares de iniciadores, 9 pares foram selecionados compreendendo 7 loci para o presente estudo: metionil-tRNA sintetase, leucil-tRNA sintetase, seril-tRNA sintetase, subunidade U5 snRNP do spliceossomo, mismatch repair ATPase, triosefosfato isomerase e GTP-binding protein. Os testes a partir de diluições seriadas dos DNAs de Trypanosoma spp., Leishmania spp. e Plasmodium spp., onde mostraram uma sensibilidade de até 1 pg/\03BCL de DNA (para o locus Leucyl-tRNA synthetase em Trypanosoma e Leishmania). A reação inicial de PCR singleplex padronizada foi eficiente para todos os loci, o que proporcionou o desenho da reação de PCR multiplex, onde o melhor resultado foi a reação número 5, a qual foi utilizada um conjunto de iniciadores dos genes GTP-binding protein, U5 snRNP spliceosome subunit e Leucyl-tRNA synthetase, que quando integrados permitiram a genotipagem multilocus de tripanossomatídeos dos gêneros Leishmania spp. e Trypanosoma spp. A metodologia aplicada para a genotipagem destas espécies de parasitas foi bem-sucedida, e pode-se destacar após a observação de conjunto de resultados que o melhor locus em termos de especificidade, sensibilidade e fidelidade aos dados encontrados na literatura, foi Leucyl-tRNA synthetase, que apresentou resultados satisfatórios em todas as análises === According to the World Health Organization (WHO), Neglected Tropical Diseases (NTDs), examples being Chagas disease, African trypanosomiasis, among others, affect about 1 billion people in the world. However, they are little studied, despite its great impact on health. Also, they include species of veterinary importance that cause great harm to the livestock industry. The kingdom Protista, containing etiological agents of NTDs, they include species of veterinary importance and that cause great harm to the livestock industry. With advances in molecular genetics, techniques such as genotyping are being used increasingly used for the study of parasitic protozoans. Orthologous genes conserved in protozoa can be used as loci for genotyping, in order to obtain a better interspecific characterization. In this study, we used singleplex and multiplex PCR techniques for genotyping of 16 species of three different genus of protozoans: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (class Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (phylum Apicomplexa). As molecular biology methods were used PCR and sequencing of PCR fragments, as well as bioinformatics, using molecular phylogeny. For this purpose, were designed 39 degenerated primers for species of 2 groups: phylum Apicomplexa and class Kinetoplastea, then, the PCR reactions were performed with the aim of standardizing multiplex PCR reactions. Moreover, parasites of importance to public health such as Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum and P. vivax were used in this study Based on the 39 pairs of primers, 9 pairs were selected comprising 7 loci for this study: methionyl-tRNA synthetase, leucyl-tRNA synthetase, seryl-tRNA synthetase, subunit U5 snRNP the spliceosome, mismatch repair ATPase, triosephosphate isomerase, and GTP- binding protein. The tests from serial dilutions of DNA from Trypanosoma spp., Leishmania spp. and Plasmodium spp., which showed a sensitivity of up to 1 pg/\03BCL DNA (for Leucyl-tRNA synthetase locus on Trypanosoma and Leishmania). The initial standardized singleplex PCR reaction was efficient for all loci, which resulted in the design of multiplex PCR reaction, where the best result was the number 5 reaction which was used a set of primers of the GTP-binding protein genes, U5 snRNP spliceosome subunit and Leucyl-tRNA synthetase, which when integrated allowed genotyping trypanosomatides multilocus of the genus Leishmania spp. and Trypanosoma spp. The methodology used for genotyping of these parasite species was successful, and can highlight after observation of the result set that the best locus in terms of specificity, sensitivity and fidelity to data found in literature, was LeucyltRNA synthetase, which showed satisfactory results in all analyzes