Genética molecular dos ritmos circadianos em mosquitos vetores (Diptera: Culicidae)

• Main Author: Cunha, Carla Gentile Rodrigues da
• Other Authors: Moreira, Luciano Andrade
• Published: 2014
• Subjects: Ritmo Circadiano; Drosophila; Culicidae; Reação em Cadeia da Polimerase
• Online Access: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/9108

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) carla_cunha_ioc_dout_2007.pdf: 1656140 bytes, checksum: 90fb142cec8bf557fc5a27f8df2af732 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === Relógios biológicos são mecanismos endógenos de marcar a passagem do tempo e podem ser encontrados em animais, plantas, fungos e até organismos unicelulares. No modelo Drosophila, o mecanismo molecular que controla os ritmos circadianos (~24 horas) funciona através de alças de retroalimentação negativa envolvendo alguns genes, sendo os principais: period, timeless, cycle e Clock. Os homólogos destes genes já foram encontrados em várias espécies de animais, apontando para uma origem ancestral comum. Mosquitos são vetores de diversos agentes causadores de doenças a humanos e animais, mas apesar da sua importância epidemiológica pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares que controlam os ritmos de atividade e hematofagia neste grupo de insetos. O presente trabalho objetivou o estudo do relógio biológico circadiano em mosquitos, usando como modelos a espécie diurna Aedes aegypti e a noturna Culex quinquefasciatus Os estudos moleculares foram sempre acompanhados de experimentos de monitoramento da atividade/repouso dos insetos. A primeira etapa da pesquisa compreendeu a obtenção em Ae. aegypti da seqüência codificante integral do gene homologo a timeless de Drosophila melanogaster e o estudo comparativo da seqüência do mesmo entre as duas espécies. Os resultados apontaram para uma alta similaridade em regiões de timeless conhecidas como importantes em Drosophila para manutenção do relógio biológico, sugerindo conservação de sua função nos mosquitos. A segunda etapa da pesquisa envolveu a determinação do padrão de expressão circadiana de period, timeless, cycle e Clock em mosquitos. Após estudos preliminares sobre a expressão de timeless e cycle em machos de Aedes aegypti, foram obtidas as curvas de expressão circadiana de period, timeless, cycle e Clock na cabeça de fêmeas de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus Os resultados sugerem que o relógio central funcione de forma muito semelhante nas duas espécies. Análise da expressão desses genes nos corpos decapitados das fêmeas de Ae. aegypti, entretanto, aponta para padrões diferentes de expressão em relação à cabeça. Foi analisado também o efeito da inseminação e da hematofagia na expressão dos genes de relógio em Ae. aegypti. Apesar de dados da literatura mostrarem que a inseminação e a alimentação com sangue (após inseminação), causam alteração no comportamento das fêmeas de mosquito, apenas a hematofagia parece exercer alteração significativa na expressão dos genes de relógio. Finalizando, foi efetuado o silenciamento de timeless em Ae. aegypti por técnica de RNA de interferência, através da injeção de RNA dupla-fita de timeless no tórax de fêmeas adultas. O silenciamento da expressão foi detectado tanto na cabeça quanto no corpo das fêmeas no quarto dia após a injeção do RNA dupla-fita, mesmo dia em que foi detectada alteração no padrão de comportamento. Esse resultado confirma o papel de timeless no controle da atividade em mosquitos === Biological clocks are endogenous time keepi ng systems that can be found in animals, plants, fungi and even unicellular organisms. In the Drosophila model, the molecular mechanism that controls the circadian rhythm (~24 hours) works through negative feedback loops composed of a number of genes, among which the principal genes are: period, timeless , cycle and Clock. The homologues of these genes have been found in many animal species and their comparison points to a common ancestral origin. Mosquitoes ar e vectors of several organisms and viruses that cause diseases in hu mans and other animals, however despite their epidemiological relevance not much is known about the molecular mechanisms controlling their activity rhythms and bloodfeedin g behaviour. The purpose of the present work was to investigate the molecular regulati on of the biological clock in mo squitoes, using as models the diurnal species Aedes aegypti and the nocturnal species Culex quinquefasciatus . Analysis of the mosquitoes’ activity/rest behaviour was performed in parallel to the molecular studies. The first stage of this research was to obtain, in Aedes aegypti , the full coding sequence of the gene homologue to the timeless gene of Drosophila melanogaster and to perform comparative analysis between them. The results s howed high similarities between the timeless gene of the two species, mainly in regions known, in Drosophila , to have a crucial involvement in the operation of the biological clock, thus sugg esting function conservation of the gene in mosquitoes. The second stage of the research involved the determination of the patterns of expression of the clock genes period, timeless , cycle and Clock in mosquitoes. After preliminary studies of male Ae. aegypti , in which the temporal pattern of the expression of timeless and cycle was determined, the circadian expression of period, timeless , cycle and Clock was characterised in the heads of females of the species Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus . The results suggest that the central clock works in a very similar way in both species. The expression of the same four genes in the behead ed bodies of females of Ae. aegypti , however, showed a pattern different from that of the head. The effect s of insemination and blood meal intake upon the expression of clock genes in Ae. aegypti were also analysed. In spite of the data in the literature showing that insemination drives important change s in the behaviour of the female mosquito, in this study only the intake of blood seemed to cau se significant changes in the expression of the clock genes. To finalize the st udy of the biological clock in mosquitoes, silencing of the timeless gene in the head and body of Ae. aegypti mosquitoes was performed using an interference RNA technique in which the thoraxes of adult females were injected with timeless double-stranded RNA. Silencing of gene expre ssion was achieved on the fourth da y after injection, the same day in which a significant alteration of the activity pattern of these females was detected. This result confirms the role of timeless in the control of activity behaviour in mosquitoes