| Summary: | A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. === Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.
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