CaracterizaÃÃo bioquÃmica e estrutural de uma lectina recombinante de sementes de Platypodium elegans Vogel

• Main Author: Raquel GuimarÃes Benevides
• Other Authors: Benildo Sousa Cavada
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal do Cearà 2011
• Subjects: lectina de leguminosa; Dalbergiae; N-glicano; cristalografia; microcalorimetria; BIOQUIMICA
• Online Access: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=7832

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico === Lectin activity with specificity for mannose and glucose has been detected in the seed of Platypodium elegans, a legume from the Dalbergiae tribe. The gene of the lectin PELa has been cloned and the resulting 261 amino acid protein belongs to the legume lectin family with similarity with Pterocarpus angolensis agglutinin (PAL) from the same tribe. The recombinant lectin has been expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. Analysis of specificity by Glycan Array evidenced a very unusual preference for complex type N-glycans with asymmetrical branches. A short branch consisting of one mannose residue is preferred on the 6- arm of the N-glycan, while extension by GlcNAc, Gal and NeuAc are favorabl e on the 3-arm. Affinities have been obtained by microcalorimetry using symmetrical and asymmetrical Asn- linked heptasaccharide prepared by semi-enzymatic method. Strong affinity of 5 μM was obtained for both ligands. Crystal structures of PELa complexed with branched trimannose and symmetrical complex type Asn-linked heptasaccharide have been solved at 2.1 and 1.65 à resolution respectively. The lectin adopts the canonical dimeric organization of legume lectins. The trimannose bridges the binding sites of two neighbouring dimers, resulting in the formation of infinite chains in the crystal. The Asn-linked heptasaccharide binds with the 6-arm in the primary binding site and extensive additional contacts on both arms. The GlcNAc on the 3 -arm is bound in a constrained conformation that may rationalize the higher affinity that is observed on chips for oligosaccharide with shorter 3-arm that do not present this monosaccharide. === Lectinas vegetais sÃo excelentes modelos para se estudar as bases moleculares do reconhecimento proteÃna-aÃÃcar.Uma atividade lectÃnica com especificidade para manose e glicose foi detectada em sementes de Platypodium elegans, uma leguminosa da subtribo Dalbergiae. O gene da lectina PELa foi clonado, resultante em uma proteÃna de 261 resÃduos de aminoÃcidos pertencente à famÃlia de lectinas de leguminosas, com similaridade com a lectina de Pterocarpus angolensis (PAL). A lectina recombinante foi expressa em cÃlulas de E. coli e refoldada à partir de corpos de inclusÃo. Uma anÃlise da especificidade por Glycan array evidenciou uma preferÃncia bastante nÃo-usual para N-glicanos do tipo complexos com ramificaÃÃes assimÃtricas. Um braÃo curto consistindo em um resÃduo de manose à preferido no braÃo 1-6 do N-glicano, enquanto uma extensÃo por GlcNAc, Gal e NeuAc sÃo favorÃveis no braÃo 1-3. Valores de afinidade foram obtidos por microcalorimetria usando heptassacarÃdeos simÃtricos e assimÃtricos ligados a Asn preparados por mÃtodo semi-enzimÃtico. Uma alta afinidade de 5 ÂM foi obtida para ambos os ligantes. Duas estruturas cristalinas de PELa, uma em complexo com um trimanose ramificado e outra com um heptassacarÃdeo complexo simÃtrico ligado a Asn foram resolvidas a resoluÃÃes de 2,1 e 1,65 Ã, respectivamente. A lectina mostrou adotar uma organizaÃÃo dimÃrica canÃnica tÃpica de lectinas de leguminsas. O trimanose faz uma ponte entre os sÃtios de ligaÃÃo a carboidrato de dÃmeros vizinhos, resultando na formaÃÃo de cadeias infinitas no cristal. O heptassacarÃdeo liga-se com o braÃo 1-6 no sÃtio primÃrio de ligaÃÃo e com contatos extensivos adicionais em ambos os braÃos. O GlcNAc do braÃo 1-3 està ligado em uma conformaÃÃo restrita que pode justificar a alta afinidade que à observada em chips para oligossacarÃdeos com braÃo 1-3 curto que nÃo apresentam esse monossacarÃdeos.