A enzima chiquimato quinase (EC 2.7.1.71) de Mycobacterium tuberculosis como alvo para o desenvolvimento de drogas

• Main Author: Rosado, Leonardo Astolfi
• Other Authors: Basso, Luiz Augusto
• Language: Portuguese
• Published: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul 2013
• Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; TUBERCULOSE; ENZIMAS
• Online Access: http://hdl.handle.net/10923/1366

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448460-Texto+Completo-0.pdf: 1711084 bytes, checksum: 65dd3daa12164398aab7aa839028c683 (MD5) Previous issue date: 2013 === Tuberculosis remains as one of the main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded Mycobacterium tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), shown to be essential for survival of bacilli, catalyzes the phosphoryl transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate (SKH), yielding shikimate-3-phosphate and ADP. Here we present purification to homogeneity, and oligomeric state determination of recombinant MtSK. Biochemical and biophysical data suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release. Isothermal titration calorimetry (ITC) for binding of ligands to MtSK provided thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each process. A comparison of steady-state kinetics parameters and equilibrium dissociation constant value determined by ITC showed that ATP binding does not increase the affinity of MtSK for SKH. In addition, there appears to be a positive free energy coupling of 3. 2 kJ mol-1 for SKH binding to MtSK:Mg2+ATP binary complex, which suggest that ATP displays negative cooperativity for SKH binding. We suggest that MtSK would more appropriately be described as an aroL-encoded type II shikimate kinase. Our manuscript also gives thermodynamic description of SKH binding to MtSK and data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction. The negative value for the change in constant pressure heat capacity (ΔCp) and molecular homology model building suggest a pronounced contribution of desolvation of non-polar groups upon binary complex formation. Thermodynamic parameters were deconvoluted into hydrophobic and vibrational contributions upon MtSK:SKH binary complex formation. Data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction are interpreted in light of astructural model to try to propose the likely amino acid side chains that are the proton donors to bulk solvent following MtSK:SKH complex formation. === A tuberculose se mantém como uma das principais causas de mortalidade ao redor do mundo devido a um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. O gene aroK que codifica a enzima Chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtSK), que se mostrou essencial para a sobrevivência do bacilo, catalisa a transferência de um grupo fosforil do ATP para o chiquimato (SKH), resultando em chiquimato-3-fosfato e ADP. O presente trabalho apresenta a purificação da proteína MtSK até a homogeneidade e a determinação de seu estado oligomérico em solução. Estudos bioquímicos e biofísicos apresentados nesta tese sugerem que a reação catalisada pela MtSK monomérica segue um mecanismo de equilíbrio rápido ordenado aleatório na adição dos substratos e uma liberação ordenada sequencial dos produtos. A análise por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) das interações não covalentes da enzima MtSK com diferentes ligantes resultou na determinação de assinaturas termodinâmicas para cada um desses eventos de ligação.A comparação entre as constantes de afinidade obtidas por espectrofotometria e ITC demostraram que o ATP não aumenta a afinidade da proteína MtSK pelo SKH. Além disso, foi determinada em + 3,2 kJ mol-1 a energia livre de acoplamento do SKH ao complexo binário MTSK:Mg2+ATP, sugerindo que o ATP possui uma cooperatividade negativa em relação ao SKH. Esse trabalho sugere que a MtSK deveria ser mais apropriadamente descrita como uma chiquimato quinase do tipo II codificada pelo gene aroL. Adicionalmente, estre trabalho demonstra a descrição termodinâmica do SKH se ligando a MtSK aonde os resultados sugerem o número de prótons que estão sendo trocados durante a interação bimolecular.O valor negativo encontrado para a capacidade calorífica em pressão constante (ΔCp) e o modelo molecular por homologia criado sugerem uma pronunciada contribuição na dessolvatação de grupos apolares relacionados à formação do complexo. As constantes termodinâmicas foram separadas na contribuição hidrofóbica e vibracional relacionadas à formação do complexo binário MtSK:SKH. Os resultados obtidos relacionados à transferência de prótons durante a formação do complexo binário foram analisados tendo como referência o modelo estrutural da enzima MtSK construído neste trabalho. De acordo com as cadeias laterais que fazem contato com o SKH no modelo proposto, se pode indicar que os aminoácidos Arg58 e Arg136 atuam como fonte de prótons durante a formação do complexo binário.