Produção da proteína recombinante anexina V humana em cultivos de Escherichia coli em batelada alimentada

• Main Author: Marder, Laura Schirmbeck
• Other Authors: Santos, Diógenes Santiago
• Language: Portuguese
• Published: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul 2013
• Subjects: BIOLOGIA CELULAR; BIOLOGIA MOLECULAR; PROTEÍNAS; MEMBRANA CELULAR; BIOFARMACÊUTICA
• Online Access: http://hdl.handle.net/10923/5517

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451784-Texto+Completo-0.pdf: 974193 bytes, checksum: b53f42e8acb1653e7c655d1d1345a38b (MD5) Previous issue date: 2013 === Annexin V is an endogenous human protein Ca+2 dependent, with a molecular weight of 35. 8 kDa, widely distributed intracellularly, with very high concentrations in the placenta and lower concentrations in endothelial cells, kidneys, myocardium, skeletal muscle, skin, red cells, platelets and monocytes. Annexin V binds preferably to phosphatidylserine, a phospholipid commonly present on inner leaflet of lipid bilayer, which during cell apoptosis is translocated to outer leaflet of cell membrane. Despite of Annexin V is a relatively large protein, it was shown early on that the protein can be internalized at sites of ischemic injury both in the heart and in the brain and cross the intact blood-brain barrier, being increasingly used as a tool to detect apoptosis in several diseases such as Alzheimer and Ischemia and in drug. Therefore, production of recombinant human Annexin V using recombinant DNA technique along with High Cell Density Culture and protein purification becomes applicable to commercialize it in Brazil, increasing and facilitating the access of pharmaceutical industries and research laboratories in purchase product. We developed a protocol to produce recombinant human annexin V in large scale, in which approximately 20 mg of recombinant protein was yielded from 3 g of E. coliBL21(DE3) wet cells. N-terminal amino acid sequencing and massspectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of therecombinant protein, as well as an apoptosis/necrosis in vitro detectionkit produced performed similarities with an imported commercialized kit in Brazil. === A Anexina V é uma proteína humana endógena dependente de Ca+2, com peso molecular de 35,8 kDa, amplamente distribuída intracelularmente em altas concentrações na placenta e em concentrações mais baixas nas células endoteliais, renais, miocárdicas, epiteliais, esqueléticas musculares, eritrócitos, plaquetas e monócitos. Apresenta como principal característica a capacidade de se ligar à fosfatidilserina, um fosfolipídeo presente na camada interna da bicamada lipídica, que durante a apoptose celular é translocada para a camada externa da membrana celular. Apesar de ser uma proteína de tamanho relativamente grande, a Anexina V apresentou a capacidade de penetrar em sítios de injúria isquêmica tanto miocárdica quanto cerebral, atravessando a Barreira Hemato-Encefálica, sendo cada vez mais utilizada para deteção de apoptose em diversas doenças como Alzheimer e Isquemia e em monitoramento de drogas anticâncer. Por esses motivos, se torna relevante a produção da proteína Anexina V humana através da técnica do DNA recombinante em larga escala para que possa ser comercializada no Brasil, aumentando e facilitando o acesso de laboratórios de pesquisa e indústrias farmacêuticas na aquisição deste produto. Desenvolvemos um protocolo para cultivoem biorreator de grandes quantidades de Anexina V recombinante, no qual aproximadamente 20 mg de proteína recombinante podem ser obtidos a partir de 3 g de célula úmida de E. coli BL21(DE3). As análises porsequenciamento N-terminal de aminoácidos e espectrometria de massas proveram evidências para a identidade e pureza da proteína recombinante, assim como um desenvolvimento de um kit para marcação de apoptose in vitro apresentou muita semelhança com outro kit importado já comercializado no Brasil.