Single molecule study of RecA recombinase enzyme activity

• Main Author: Mah, Wayne
• Other Authors: Hung-Wen Li (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2008
• Subjects: Chemistry - Physical
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=18743

Homologous recombination is an essential pathway in the repair of DNA damage during the DNA replication process. RecA protein promotes the central steps in homologous recombination, after coating single-stranded DNA (ssDNA), RecA carries out a pairing and strand exchange reaction involving homologous DNA. This research project aims to characterize RecA function in homologous recombination using single molecule tethered particle motion (TPM). Using TPM to observe RecA extension along DNA, the RecA extension rate on ssDNA was determined for the first time. The rate obtained for dsDNA was similar, implying that RecA polymerizes along only one strand of a DNA substrate. The nucleation behaviour of RecA on DNA was also obtained from the extension trace, confirming the hypothesis that rapid nucleation on ssDNA is pH independent, while nucleation on dsDNA is pH dependent. Several pilot single molecule experiments aimed at monitoring the pairing and strand exchange reaction in real time were attempted. Although these experiments were unsuccessful, successful ensemble biochemical analogues of these experiments proved the feasibility of the single molecule experiments. These attempts gave insights into possible factors hindering success and led to experimental suggestions essential to the success of future experiments. === La recombinaison Homologue est un chemin essentiel dans la réparation de dommages d'ADN pendant le procédé de réplication d'ADN. La protéine de RecA promeut les étapes centrales dans la recombinaison homologue, après avoir revêtu ADN seul-abandonné (ssDNA), RecA exécute un mettre et la réaction d'échange de brin impliquant ADN homologue. Ce projet de recherche vise à caractériser la fonction de RecA dans la recombinaison homologue utilisant la molécule seule mouvement de particule attaché (TPM). TPM d'utilisation pour observer l'extension de RecA le long d'ADN, le taux d'extension de RecA sur ssDNA a été déterminé pour la première fois. Le taux obtenu pour dsDNA était similaire, impliquant ce RecA polymerizes le long de seulement un brin d'un substrat d'ADN. Le comportement de nucleation de RecA sur ADN a été aussi obtenu de la trace d'extension, confirmant l'hypothèse ce nucleation rapide sur ssDNA est indépendant du pH, pendant que nucleation sur dsDNA est dépendant du pH. Plusieurs pilote plusieurs expériences de molécule seules ont visé à contrôlant le mettre et la réaction d'échange de brin a été tentée en temps réel. Bien que ces expériences étaient les ensembles infructueuses et réussies analogues biochimiques de ces expériences ont prouvé la possibilité des expériences de molécule seules. Ces tentatives ont donné de l'aux perspicacités dans les facteurs possibles freinant le succès et a mené à l'élément essentiel de suggestions expérimental au succès d'expériences futures