| Summary: | With increasing incidences of early onset of cancer and the delay of reproductive age, the demand for fertility preservation in women have increased. Even though most results of oocyte cryopreservation have been obtained from ovarian stimulation protocols for in vitro fertilization (IVF), ovarian stimulation with gonadotropins may not be suitable for many women, especially those who are with hormone-dependent cancers, or those require immediate chemotherapy. However, it is agreed that the outcome of in vitro matured (IVM) oocytes are not as good as in vivo matured ones. In this thesis, we tested the interfering of oocytes during IVM, by the addition of antioxidant and the blocking of mitochondrial function, and observed their survival and the outcome of embryonic development after vitrification and IVF. For the first part, our study showed that the presence of the antioxidant, cysteamine during IVM significantly (P<0.05) reduced the fragmentation rate in cumulus-intact group from 61.9% to 40.8% following vitrification-thawing and IVF. However, the same trend wasn't shown in denuded groups. Nevertheless, there were no significant differences in terms of maturation and cleavage rate with the supplementation of cysteamine in either COC or denuded groups. We hypothesized that cysteamine facilitated effect during IVM might have occurred by affecting mtDNA accumulation during IVM. Fluorescent real-time quantitative analysis of mtDNA showed that the mtDNA copy number were similar in cysteamine treated and untreated group with a ratio close to 1, which implied that the effect of cysteamine during IVM may not be directly related to the mtDNA replication. In the second part, a mitochondria blocker, rotenone, was added to the IVM medium in order to test the vitrification outcome and the subsequent embryonic development. The testing of rotenone concentrations from 100nM to 50µM, showed a lethal dose of around 50µM where all the oocytes were lysed during IVM. With the increase of rotenone concentration from 2µM to 50µM, the oocyte maturation rate dropped significantly in a dose dependent manner and eventually reaching 0 when the concentration was at 50µM. Within the concentration window of 250nM to 2µM, where no difference has been found in terms of the oocyte death and maturation rates compared to the control, there is a significant drop of cryo-survival rate at a concentration of 2µM, from 93.3% (in the control) to 55.6%. The percentage of embryos that developed to 4-8 cell stage were significant lower in the 2µM group (17.5%), compared to the group with a lower concentration of 250nM (50%). This study confirmed the strong positive dependency of mitochondrial functionality during oocyte maturation on its later development as well as the cryopreservation outcomes. Our work suggested that as two individual ART applications, the understanding and improvement of IVM could improve the outcome of vitrification since the impact of IVM on the oocytes could significantly determine the oocytes ability to survival and to develop following vitrification and IVF. === Suite a làugmentation de l'incidence des pathologies cancéreuses chez les jeunes et au recul de l'âge parental, les demandes de préservation de la fertilité sont de plus en plus fréquentes. Bien que la majorité des résultats sur la cryopréservation des ovocytes aient été obtenu suite a un protocole de stimulation ovarienne dans le cadre d'un traitement par fécondation in vitro (FIV), làdministration de gonadotrophines est inappropriées pour un certain nombre de patientes, en particulier celle atteintes de cancer hormono-dépendant, ou celle nécessitant une chimiothérapie sans délai possible. D'autre part, il est bien établi que le taux de fécondation des ovocytes maturés in vitro (IVM) n'est pas aussi élevé que lorsque les ovocytes sont maturés in vivo. Dans cette thèse, nous avons testé l'effet de la présence d'antioxydants et d'inhibiteurs de la fonction mitochondriale dans le milieu de maturation in vitro sur le taux de maturation ovocytaire (IVM) ainsi que sur le taux de survie et de développement embryonnaire après vitrification. Dans un premier temps, nous avons démontré que la présence d'antioxydants, la cysteamine, pendant l'IVM réduit significativement le taux de fragmentation après vitrification des ovocytes maturés avec leur cellules du cumulus (complexes ovocyte-cumulus, COC), de 61.9% dans le groupe non traité à 40.8% dans le groupe traité (p<0.05). Cette différence n'est pas observée dans le groupe des ovocytes maturés en l'absence de leur cellules du cumulus (ovocytes dénudés). La présence de cysteamine n'a pas d'effet significatif sur le taux de maturation et de clivage embryonnaire que les ovocytes soient dénudés ou non. Nous avons ensuite vérifié si l'effet bénéfique de la cysteamine durant l'IVM était lié à l'accumulation de DNA mitochondrial durant la maturation ovocytaire. Le nombre de copies d'aDN mitochondrial dans les ovocytes maturés en présence ou non de cysteamine a donc été évalué par PCR quantitative et le résultat ne montre pas de différence significative entre les deux groupes (ratio ~1). Ces données ne sont donc pas en faveur d'un effet de la cysteamine sur la réplication de l'aDN mitochondrial lors de la maturation ovocytaire in vitro. Dans un deuxième temps, un inhibiteur de la fonction mitochondriale, la rotenone, a été ajoutée au milieu de maturation in vitro afin de tester son effet sur la vitrification et le développement embryonnaire ultérieur. Les tests d'échelonnement de concentrations, de 100nM a 50µM, ont permis de définir une dose l'etale de 50µM, pour laquelle la totalité les ovocytes sont lysés. Entre 2µM et 50µM, le taux de maturation diminue de manière dose dépendante, atteignant 0 à la dose maximale. Dans une échelle de concentration allant de 250nM à 2µM, aucune différence significative n'est observée en terme de taux de survie et de maturation entre le groupe traité et le groupe contrôle. Par contre le taux de survie après vitrification diminue en présence de 2µM de roterone dans le milieu IVM, passant de 93.3% dans le groupe contrôle à 55.6% dans le groupe traité. Le taux d'embryons atteignant 4-8cellules après fécondation est également significativement plus bas dans le groupe traité à une concentration de 2µM comparé à un groupe traité à une dose plus faible de 250nM (respectivement 17.5% et 50%). Cette étude confirme le rôle essentiel des mitochondries durant la maturation ovocytaire, le développement ultérieur et la survie après cryopréservation. Notre travail montre l`interaction entre deux techniques utilisées en Procréation Médicalement Assistée : la maturation in vitro d'une part et la vitrification d'autre part. La compréhension et le développement des milieux de maturation ovocytaire in vitro ont en effet un impact majeur sur la survie des ovocytes après vitrification et sur leur développement embryonnaire ultérieur.
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