Étude structurale et fonctionnelle de la protéine Core du virus de l'hépatite C

• Main Author: Duvignaud, Jean-Baptiste
• Other Authors: Gagné, Stéphane
• Format: Doctoral Thesis
• Language: French
• Published: Université Laval 2012
• Subjects: Virus de l'hépatite C; Protéines de la capside
• Online Access: http://hdl.handle.net/20.500.11794/23364

Le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique avec au dessus de 120 millions de personnes infectées et à ce jour aucun traitement capable de contrer de manière efficace ce virus. Le VHC a été découvert en 1989, classé dans la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hepacivirus. Il s’agit d’un virus enveloppé, formé donc d’une bicouche lipidique, d’une capside, et d’un acide nucléique (ARN). La capside virale est formée d’une seule et unique protéine appelée « Core ». Il s’agit d’une protéine de 177 acides aminés sous sa forme mature. Il a été démontré au sein du laboratoire du Professeur Denis Leclerc que la première moitié de la protéine (C82) était suffisante pour générer à la fois in vivo et in vitro la formation de la capside virale. Ayant comme objectif de comprendre les mécanismes régissant l’assemblage viral, nous avons étudié cette protéine d’un point de vue structural. Suite à la mise au point d’un protocole robuste d’expression, de marquage isotopique et de purification, nous avons étudié la Core C82 par dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la Core C82 est non structurée et flexible, confirmant ainsi l’analyse de la séquence primaire et les prédictions de structure secondaire de la Core. Nous avons ainsi mis en évidence que la moitié N-terminale de la Core du VHC appartenait à la famille des protéines intrinsèquement non structurées (IUP). Les IUPs sont des protéines peu ou très peu structurées et parfois capables de se structurer en liaison à un partenaire (protéine, acide nucléique, petite molécule). Nous avons donc, dans le but de structurer la Core C82, testé de multiples conditions de sel, détergent, agent lipomimétique et un partenaire protéique (protéine p53). Seul l’ajout d’un agent lipomimétique (2,2,2-trifluoroéthanol, TFE) à la Core C82 est venu modifier sa structure et sa dynamique. Nous avons ainsi pu démontrer que la Core C82 pouvait adopter une structure en hélice α. Nous avons, de plus, confirmé que ce repliement était également présent dans des versions tronquées plus longues de la Core (formes C124 et C170). Enfin, nous avons, parallèlement à son étude structurale, mis au point un test in vitro d’inhibition de l’assemblage. Cet outil nous a permis de découvrir plusieurs peptides dérivés de la séquence protéique de la Core et de la protéine NS5A du VHC, ayant un effet inhibiteur sur l’assemblage viral in vitro de la Core mature (C170). Ces travaux innovateurs représentent une avenue encourageante vers la découverte d’un moyen efficace de soigner l’infection au VHC. Au final, même si la structure 3D de la Core mature reste non déterminée, notre étude structurale de la Core C82 est la plus complète réalisée à ce jour à l’échelle atomique. Par ailleurs, nos travaux préliminaires sur la forme mature de la Core (C170) semblent être très prometteurs et permettraient de déterminer la structure 3D de la protéine Core mature. === The hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem with more than 120 million infected people, and to date no efficient treatment is available. HCV was discovered in 1989, classified in the flaviviridae family, and is the only member of the hepacivirus genus. It is an enveloped virus, consisting in a lipid bilayer, a capsid, and a ribonucleic acid (RNA). The viral capsid is composed by only one protein called “Core” protein. It is a 177 amino acid long protein in its mature form. It was demonstrated in our laboratory that the first half of this protein (C82) was sufficient to generate, both in vivo and in vitro, the assembly of the viral capsid. In order to understand the mechanism controlling the capsid assembly, we have studied the structural aspect of this protein. After developing robust protocols of overexpression, isotope labelling and purification of the protein C82, we studied this truncated form using circular dichroism and nuclear magnetic resonance. The experimental data obtained suggest that Core C82 is an unstructured and very flexible protein, thus confirming primary sequence analysis and secondary structure predictions. We established that the N-terminal half of the Core protein is a member of the intrinsically unstructured protein family (IUP). IUPs are proteins which are totally or partially unstructured, but can sometimes undergo a structural change induced by the binding of a partner (protein, nucleic acid, small molecule). In order to induce a structured form of the C82 protein, we have tested a large range of conditions of salt, detergent, lipomimetic solvent, as well as interaction with a proteic partner (p53). Only the addition of a lipomimetic agent (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) to the Core C82 protein resulted in a structural and a dynamical change. In this special condition, we were able to demonstrate that the Core C82 can adopt an α-helix conformation. We have, moreover, confirmed that this conformation was also present in longer truncated form of the Core protein (C124 and C170). We also, along its structural analysis, developed an in vitro test to inhibit the assembly of the Core protein. This tool allowed us to discover several small peptides derived from the HCV Core and NS5A proteins amino acid sequences, with an inhibitory effect on the viral assembly of the mature Core protein (C170). This innovative work is potentially an interesting step towards the development of an efficient treatment against HCV. Ultimately, even if the 3D structure of the mature Core protein remains unsolved, our structural study of the C82 truncated form is the most comprehensive study to date at an atomic resolution. Moreover, our preliminary works on the mature form of the Core protein (C170) are very promising and should eventually lead to the three dimensional structure.