Zwei-Photonen-Endomikroskopie
In der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für die Zwei-Photonen-Endomikroskopie untersucht. Die Herausforderung liegt in der Miniaturisierung der Technik der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um auch endoskopisch in vivo hochauflösende Bilder von Gewebestrukturen und Zellen zu erhalten. Im Gegensatz...
Main Author: | |
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Format: | Others |
Published: |
Ludwig-Maximilians-Universität München
2015
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Online Access: | http://edoc.ub.uni-muenchen.de/18340/1/Thomsen_Katharina.pdf http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-183409 |
Summary: | In der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für die Zwei-Photonen-Endomikroskopie untersucht. Die Herausforderung liegt in der Miniaturisierung der Technik der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um auch endoskopisch in vivo hochauflösende Bilder von Gewebestrukturen und Zellen zu erhalten. Im Gegensatz zur Gewebeentnahme bei einer Biopsie ist dieses optische Verfahren minimal-invasiv. Damit ist eine Vorab Untersuchung des Gewebes möglich, die die Diagnostik unteranderem von bösartigen Gewebestrukturen präzisieren könnte. Die konfokale Endoskopie bietet bereits mit einem vergleichbaren Verfahren die Möglichkeit einer optischen Biopsie an der Oberfläche, z.B. an verschiedenen Schleimhäuten. Aufgrund der Gewebestreuung ist die Eindringtiefe des Lichts dabei aber auf wenige Mikrometer begrenzt. Diese Einschränkung könnte durch die bereits in der Zwei-Photonen-Mikroskopie gezeigte größere optische Eindringtiefe durch die Zwei-Photonen-Endomikroskopie verbessert werden.
In dieser Arbeit wurde ein Femtosekundenlaser durch Glasfasern geleitet und am distalen Ende mit Hilfe einer Mikrooptik fokussiert. Dazu wurde ein Aufbau basierend auf Faserbündeln gewählt. Die einzelnen Faserkerne des Glasfaserbündels wurden mit einem Galvanometer-Scanner abgerastert und die dazugehörige detektierte Fluoreszenz punktweise zu einem Bild zusammengesetzt. Zur Kompensation der zeitlichen Verbreiterung der Pulse wurde ein Gitterkompressor aufgebaut. Mit diesem Aufbau wurden Zwei-Photonen-Fluoreszenz Aufnahmen von fluoreszenzstarken Proben durch ein Faserbündel ermöglicht. Diese Arbeit zeigt die Machbarkeit der Zwei-Photonen-Endoskopie und zeigt Möglichkeiten zur Optimierung, um zukünftig auch einen klinischen Einsatz zu ermöglichen. Mit der verwendeten Mikrooptik wurde eine zelluläre Auflösung von (3,5 ± 0,3) μm lateral und (5,3 ± 0,1) μm axial erreicht. Durch die Verwendung eines Referenzsystem aus Mikroskopobjektiven im Austausch der Mikrooptik konnte gezeigt werden, dass vor allem die laterale Auflösung noch verbessert werden konnte. Entscheidend ist hierfür eine hohe distale numerische Apertur. Der zukünftige Einsatz von verbesserten Mikrooptiken kann somit die Auflösung noch erhöhen. Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass diese zukünftig auch kommerziell erhältlich sein könnten. Zusätzlich wurde eine variable Fokussiereinheit auf Basis eines Drahts aus einer Formgedächtnislegierung (Nitinol) realisiert. Damit konnte der Abstand zwischen Mikrooptik und Gewebeoberfläche verstellt werden. Durch Applikation eines maximalen Stromes bis zu 385mA kontrahiert der Nitinoldraht um ca. 1,8%. Ab dem minimalen Aktivierungsstrom von 330 mA konnte ein linearer Zusammenhang zwischen der Stromstärke und der Verschiebung beobachtet werden. Eine Änderung der Stromstärke in Schritten von 16–12 mA. ermöglicht eine Verschiebung von 20–10 μm.
Eine Herausforderung ist die Erzeugung und Detektion der Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe zur Erzeugung von aussagekräftigen Zwei-Photonen-Bildern. Die Leistungsverluste der Laserenergie im Anregungsweg und die Verluste des Fluoreszenzsignals im Detektionsweg müssen hierfür möglichst gering gehalten werden. Die größten Verluste im Anregungsweg gibt es durch den Gitterkompressor, durch die Fasereinkopplung und durch die Mikrooptik. Trotzdem ist die hier erreichte Gesamttransmission von 18% (λ0 = 800 nm) ohne Gitterkompressor vergleichbar mit der erster Zwei-Photonen-Mikroskope. Durch Optimierung einzelner Komponenten, vor allem des Gitterkompressors und der Mikrooptik, ist zukünftig eine bessere Transmission möglich.
Die Erzeugung von Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignalen wird auch durch die Pulsverbreiterung innerhalb des Faserbündels verringert. Sowohl lineare als auch nichtlineare Effekte verbreitern spektral und zeitlich die Pulse. Die Untersuchung dieser Effekte konnte zeigen, dass mit Hilfe eines Gitterkompressors die zeitliche Pulsdauer am Faserausgang bis auf ca. 10 fs wiederhergestellt werden konnte und damit die Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung verbessert werden konnte. Trotzdem konnten bereits bei den hier verwendeten Leistungen (5–65 mW) auch nichtlineare Effekte beobachtet werden. Dazu kommt, dass bei höheren Laserintensitäten keine Transmission mehr möglich ist und die Eigenfluoreszenz der einzelnen Fasern des Faserbündels die Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe überlagert.
Zur Beseitigung der hier gezeigten Limitierungen durch die Mikrooptik und durch das Faserbündel sind weitere Optimierungen nötig um den Einsatz eines Zwei-Photonen-Endoskops in vivo zu ermöglichen. Durch den nichtlinearen Zusammenhang zwischen der Photonenintensität und der Fluoreszenzanregung sind diese Limitierungen gravierender als bei einer normalen Fluoreszenzanregung. Eine Reduzierung der Spitzenintensitäten der Laserpulse bei einem gleichzeitigen Erhöhen der Laserrepetitionsrate könnte zukünftig die nichtlinearen Effekte reduzieren und die effektive Laserleistung am Faserausgang erhöhen. === In the present thesis, the basis for two-photon endomicroscopy was examined. The challenge is to miniaturize the technique oft two-photon microscopy to endoscopically obtain in vivo high-resolution images of tissue structures and cells. In contrast to tissue extraction during a biopsy this optical method is minimal-invasive. This optical method is minimally invasive, as no tissue, such as in a biopsy, has to be taken. Thus, a preliminary examination of the tissue is possible, which could increase the precision of the diagnosis of e.g. malignant tissue structures. Confocal endoscopy already enables to obtain optical biopsies at the tissue surface, for example at various mucous membranes, applying a similar method. Due to tissue scattering, the penetration depth of light is limited to a few micrometers. This limitation could be reduced by the higher optical penetration depth of the two-photon microscopy.
In this thesis a femtosecond laser was guided through a glass fiber and was focused at the distal end with a micro optic. For this purpose, a setup was selected based on fiber bundles. The individual cores of the fiber bundle were scanned with a galvanometer scanner and the associated fluorescence signal was detected pointwise to then compose one complete image. To compensate for the temporal pulse broadening a grating compressor was constructed. This setup enables two-photon fluorescence recordings of samples with a high fluorescence emission through a fiber bundle. This work demonstrates the feasibility of two-photon endoscopy and shows possibilities for optimizing in order to enable future clinical use. A cellular resolution of laterally (3,5 ± 0,3) μm and axially (5,3 ± 0,1) μm was achieved with the used micro-optic. Especially the lateral resolution could be improved by using a reference system composed of microscope objectives in the exchange of the micro-optics. Crucial for this is a high distal numerical aperture. The future use of improved micro-optics can thus increase the resolution. Recent research suggests that this could become commercially available in the future. In addition, a variable focusing unit was realized on the basis of a shape memory allow wire (nitinol wire). Thus, the distance between micro-optics and tissue surface could be changed. By applying a maximum current up to 385 mA the nitinol wire contracted by about 1,8%. A linear relationship between the current and the displacement could be observed beginning at the minimum activation current of 330 mA. A change of current in steps of 16–12 mA allows a displacement of 20–10 μm.
One challenge is the generation and detection of the fluorescent signals from the tissue to generate meaningful two-photon images. The power losses of the laser energy in the excitation path and the loss of the fluorescence signal in the detection path must be kept as low as possible for this purpose. The grating compressor, the fiber coupling and micro-optics cause the highest losses in the excitation path. The achieved total transmission of 18% (λ0 = 800 nm) without the grating compressor is nevertheless comparable with the total transmission of first two-photon microscopes. In future a better transmission is possible through optimization of individual components, especially the grating compressor and micro-optics.
The pulse broadening through the fiber bundle also reduces the generation of two-photon fluorescence signals. Linear and non-linear effects spectrally and temporally broaden the pulses. The study of these effects showed that the temporal pulse duration could be restored to approximately 10 fs at the fiber output with the help of a grating compressor, and thus the two-photon fluorescence excitation could be improved. Nevertheless, already with the applied power (5–65 mW) nonlinear effects could be observed. In addition, at higher laser intensities no transmission is possible, and is superimposed on the self-fluorescence of the individual fibers of the fiber bundle, the fluorescence signals from the tissue.
Further improvements are necessary to eliminate the found limitations, which are caused by the micro-optics and the fiber bundle, to allow the use of a two-photon endoscope in vivo. These limitations are more serious than in normal fluorescence excitation, because of the non-linear dependency between the photon intensity and the fluorescence excitation. A reduction in the peak intensities of the laser pulses with a simultaneous increase of laser repetition rate could reduce the nonlinear effects and increase the effective laser power at the fiber output in future. |
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