Estructura tridimensional del factor de terminación mitocondrial humano, mTERF en complejo con DNA

• Main Author: Jiménez Menéndez, Nereida
• Other Authors: Coll Capella, Miquel
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Spanish
• Published: Universitat Autònoma de Barcelona 2011
• Subjects: Ciències Experimentals; 548 - Cristal·lografia
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/48649; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:9788469434628

El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena localizada en la matriz mitocondrial. La transcripción del DNAmt se inicia a partir de tres promotores localizados en el D-loop, uno para la cadena ligera (L) y dos para la cadena pesada (H1 y H2). Las unidades de transcripción que se inician en H2 y en L producen una especie policistrónica gigante que cubre casi toda la cadena. En cambio, la transcripción iniciada en H1 se termina en el extremo 3’ del rRNA 16S. El papel principal de esta atenuación se debe al factor de terminación de la transcripción, mTERF. mTERF, es una proteína codificada en núcleo, cuya forma madura tiene 342 aminoácidos. Se ha descrito que se une a varios lugares estratégicos del DNA mitocondrial, donde controla procesos como la terminación de la transcripción o la pausa de la maquinaria de replicación mitocondrial. De estos lugares, el que presenta mayor afinidad es la secuencia de 28 pares de bases (DNA28pb) en el gen del tRNALeu(UUR) mitocondrial. Ensayos in vitro han demostrado que la unión de mTERF a esta región provoca la terminación de la transcripción del DNA mitocondrial en ambos sentidos. En este trabajo se estudia, desde un punto de vista estructural y mediante técnicas de cristalografía de proteínas, el complejo de mTERF con el DNA que contiene la secuencia de terminación. Durante la producción de mTERF recombinante, la proteólisis espontánea de la forma entera de la proteína (Arg56-Ala399) dio lugar a una variante corta, mTERF-ΔN (Arg99-Ala399) que mantenía la unión al DNA. Se determinó la estructura tridimensional del complejo con DNA de mTERF-ΔN a 2.4 Å de resolución. La disposición del DNA en el eje z del cristal provocó que los cristales de mTERF-ΔN en complejo con un DNA29pb, con un parámetro c de la celda unidad demasiado pequeño para albergarlo, presentaran graves problemas de anisotropía y desorden, dando lugar a mapas de densidad electrónica muy distorsionados. Se realizaron entonces ensayos de cristalización con oligonucleótidos de menor longitud, pudiéndose trazar y refinar el DNA y la proteína completa con los cristales de mTERF-ΔN en complejo con el DNA12pb. La estructura del fragmento ΔN se usó para resolver la estructura del complejo de mTERF entera con el DNA15pb a 3.1 Å de resolución. En estos cristales, la proteína interacciona mediante los subdominio N-terminal y C-terminal con dos moléculas de DNA simétricas que no interaccionan entre ellas y cuya posición relativa viene dada por un ángulo de ~36º. mTERF se une a la largo del surco mayor del DNA, estableciendo contactos con los fosfatos mediante 19 residuos y con bases nitrogenadas mediante 5 residuos. La estructura cristalográfica de mTERF consiste en nueve repeticiones estructurales, de TERF-I a IX, flanqueadas por un segmento N-terminal y una hélice α C-terminal. Cada motivo TERF está formado por unos 35 aminoácidos que se estructuran en tres hélices α (H1, H2 y H3) formando una superhélice trigonal levógira con un núcleo hidrofóbico central. La combinación de la conectividad en superhélice levógira con la propagación en tándem del motivo para formar un solenoide es única de las proteínas de la familia MTERF. En base a la estructura cristalográfica se generaron modelos para estudiar los complejos en solución mediante la técnica de SAXS. La representación gráfica del error asociado al ajuste entre la curva teórica de dispersión para cada modelo y la curva medida experimentalmente, presenta un mínimo, indicando que la unión de mTERF al DNA28pb se da preferentemente sobre una zona del DNA. Los ensayos de unión y especificidad de mTERF y las formas truncadas de ésta con el DNA28pb mediante geles nativos de retardo muestran que mTERF-ΔC y ΔN-mTERF-ΔC no unen DNA y que mTERF y mTERF-ΔN lo unen específicamente. === The human mitochondrial genome is a closed circular molecule located within the mitochondrial matrix. mtDNA transcription is initiated from tree promoters in the D-loop, one for L-strand (L) and two for the H-strand (H1 and H2). Transcription from H2 and L proceeds around the mtDNA circle, creating a polycistronic RNA. On the other hand, transcription initiated in H1 ends at the 3’end of rRNA 16S. The main role of this attenuation is due to the mitochondrial transcription termination factor mTERF. mTERF, is a nucleus-encoded protein whose mature form has 342 amino acids. It has been described that mTERF binds to several strategic mtDNA sites, where it controls processes such as transcription termination or pausing of the replication machinery. Among them, the 28bp sequence from the tRNALeuUUR gene shows the highest affinity of binding to mTERF. In vitro assays have shown that binding of mTERF to this site promotes termination of transcription bidirectionally. We study, from a structural point of view, the mTERF complex with the oligonucleotide containing the termination sequence. During recombinant mTERF production, spontaneous proteolysis of the full-length protein (Arg56–Ala399) yielded a shorter variant (Arg99–Ala399; mTERF-ΔN) yet DNA-binding form. The three-dimensional struc¬ture of mTERF-ΔN was determined from SeMet-derivatized crystals at 2.4Å resolution. In the first mTERF-ΔN-DNA crystals, the arrangement in the z-axis of the large 29bpDNA molecule, compared to the c parameter of the unit cell, caused severe problems of anisotropy and disorder, which resulted in low quality electron density maps. Then crystallization assays were performed with shorter oligonucleotides, being able to trace and refine the complex structure with mTERF-ΔN-12bpDNA crystals. The structure of ΔN fragment was used to solve the full-length mTERF structure at 3.1Å resolution in complex with 15bpDNA. In these crystals, two crystallographically related identical oligonucleotides related by ~36° are bound by two distinct regions of a single protein moiety, the N-terminal and C-terminal subdomains. mTERF wraps round the DNA along the major groove through 19 nonspecific interactions with both dsDNA backbone phosphates and 5 interactions with DNA nitrogen bases. mTERF consists of nine structural repeats, TERF-I–TERF-IX flanked by an N-terminal extended segment and a C-terminal α-helix C. Within each repeat, roughly 35 residues fold into three α-helices (H1, H2 and H3) that are arranged in a left-handed triangular superhelix around a central hydrophobic core. The combination of left-handed helical connec¬tivity with tandem propagation is unique to mTERF. Based on the crystallographic structure, we constructed models to study the complex in solution by small-angle X-ray scattering (SAXS). The graphical representation of agreement of each of the models to the experimental SAXS curve presents a minimum, indicating the specificity of the binding between mTERF and the 28bpDNA. The 28bpDNA binding affinity and specificity of mTERF and truncated forms, assayed by native gels, shows that mTERF-ΔC and ΔN-mTERF-ΔC do not bind DNA while mTERF and mTERF-ΔN bind it specifically.