噬菌體XP�滌穧]轉錄的控制

• Main Authors: LIAO, YOU-DI, 廖有地
• Other Authors: GUO, ZONG-DE
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/23548571134036609388

博士 === 國立臺灣大學 === 植物學研究所 === 73 === Xp10為水稻白葉枯病病原菌Xanthomonas campestris pv 。oryzae之溶解性噬菌體， 當Xp10感染寄主細菌後，菌體內之轉錄系統由對rifampicin敏感轉變為對rifampicin 有抗性，經酵素分析後，發現寄主原本對rifampicin敏感的RNA 聚合活性，因Xp10 的感染而下降，接著又產生一抗rifampicin的RNA 聚合，取代寄主的RNA 聚合。 為了探討寄主RNA 聚合對Xp10基因體轉錄的情形及其活性如何因Xp10感染而下降， 因此分別以PEG 沈澱法、DEAE-cellulose，heparin sepharose 4B及blue dextran s epharose 4B 等層析法將感染前、後之寄主RNA 聚合加以純化，經７．５％SDS-po lyacrylamide膠體電泳分析，發現寄主RNA 聚合次單位中α2 ββ’σ中的σ次單 位因Xp10感染而遺失；同時感染後之寄主RNA 聚合的模版專一性也因而改變，未感 染者可利用Xp10 DNA及寄主DNA 為模版合成RNA ，而感染後者則不能轉錄Xp10 DNA 及寄主DNA ，僅能轉錄poly d(A-T) 。接著再比較其差異性，譬如對於spermidine 的促住作用，actinomycin D 及blue dextran之抑制作用亦有所差異，其他特性如RN A 合成之最適二價陽離子濃度、最適溫度、最適pH值及對於鹽類、NEM 、rifampicin ,cnngo red，heparin ，ethidium bromide之抑制作用並沒有顯著改變；以polyacry lamideagarose 混合膠體電泳分析兩種RNA 聚合對Xp10之轉錄產物，得知感染前之 寄主RNA 聚合可得到五條主要的RNA 帶，而感染後之寄主RNA 聚合僅得到較弱的 兩條RNA 帶，為了繼續追這兩種酵素對Xp10 DNA轉錄的專一性是否改變，因此分別 以其轉錄Xp10 DNA所得之 P-RNA 為偵測體（probe ），對Xp10 DNA片斷進行DNA- RNA 雜交試驗，發現兩者均只能轉錄Xp10 DNA左端２５∼３０％部份。接著以從Xp10 感染菌體中分離出的Xp10抑制因子，對感染前之寄主RNA 聚合作用，發現可抑制其 對Xp10 DNA及寄主DNA 之轉，而與感染後之寄主RNA 聚合特性相似。但是此抑制因 子不改變感染後寄主RNA 聚合對Xp10 DNA及寄主DNA 之轉錄能力。 Xp10感染後，除了寄主RNA 聚合被抑制外，又產生－Xp10 RNA聚合負責轉錄Xp10 晚期基因；同樣以上述純化步驟加以純化，經７．５％SDS 膠體電泳分析後，得知它 為分子量９８，０００之單一蛋白質RNA 聚合，嗜好以加熱處理過之Xp10 DNA，ca lf thymus DNA 及poly d(A-T) 為模版合成RNA ，對自然、雙股（native, double s trand ）的DNA 及poly d(C) ．poly d(G) 之轉錄能力則較差，但只合成poly r(G) ，不合成poly r(C) 。若以加熱處理之calf thymus DNA 為模版，受質ATP 單獨存在 時,可合成poly r(A)。正常之轉錄作用須有四種受質、DNA 模版及鎂離子同時存在； RNA 合成之最適鎂離子濃度為１６mM，最適溫度為３７℃，最商pH值為８．０，受質 ATP 之Km值為２６μm ，spermidine可抑制其酵素活性，５０mM的KCI 可抑制其９０ ％的酵素活性。６０μg ／ml的actinomycin D ，heparin ，blue dextran，ethidi um bromide可完全抑制其活性，而對同一濃度的rifampicin及streptovaricin具有抗 性。其酵素活性部位（active site ）不具－SH基。Xp10 RNA聚合轉錄Xp10 DNA 之RNA 產物，經polyacrylamide-agarose混合膠體分析後，得到兩條主要的RNA 帶， 再以此 P-RNA 為偵測體，對Xp10 DNA片斷做DNA-RNA 雜交分析，得知Xp10 RNA聚合 僅轉錄Xp10 DNA右端７０∼７５％部份。 為了驗證在生體內（in vivo ）Xp10基因體轉錄的方向，是否亦由Xp10 DNA物理圖譜 左端進行，因此分別抽取Xp10感染後不同時間菌體內之 P-RNA ，再依上法做雜交試 驗，結果證明仍由左端向右端的方向轉錄。 由以上結果歸納如下：Xp10感染寄主細菌後，寄主RNA 聚合負責轉錄Xp10早期基因 ，再由早期基因產物－Xp10抑制因子抑制寄主RNA 聚合活性，再以另一早期基因產 物－Xp10 RNA聚合負責轉錄Xp10晚期基因。