Cloning, characterization and distribution of two new insertion sequences, IS1403 and IS1404, in Xanthomonas campestris.

• Main Authors: Chiu, Shu-Ping, 邱淑萍
• Other Authors: Lee Yung-An
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Published: 1996
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/37898903141836881398

碩士 === 輔仁大學 === 生物學系 === 84 === Xanthomonas campestris pv. juglandis 具 有 一 段 重 複 序 列 (repetitive sequence) ， 經 核 酸 定 序 與 分 析 結 果， 發 現 該 DNA 片 段 中 含 有 一 個 插 入 序 列 (insertion sequence; IS)， 並 經 命 名 為 IS1403 。 另 外 X. c. pv. campestris 亦 含 有 與 IS1403 相 同 性 達 91% 的 插 入 序 列， IS1404 。 IS1403 及 IS1404 長 度 均 為 1,203 bp， 具 有 4 bp direct repeat 及 42 bp 之 inverted repeat ， 兩 者 皆 有 二 個 open reading frames (ORFA 及 ORFB)， 兩 者 以 phase 0, -1 的 形 式 存 在。 ORFA 及 ORFB 間 有 A6G motif ， 其 後 具 有 一 含 7-bp stem-loop 的 pseudoknot 結 構 ， 與 IS3 family 之 插 入 序 列 及 反 轉 錄 病 毒 的 -1 translational frameshift motif 位 置 有 極 高 相 似 性 。 令 外 ， ORFB 存 在 一 IS3 family 之 轉 位 酵 素 與 反 轉 錄 病 毒 的 插 入 酵 素 中 相 同 之 DD(35)E motif 。 雖 然 IS1403 與 IS1404 具 有 上 述 之 特 性 ， 但 在 核 酸 序 列 相 似 性 上 與 IS3 family 之 差 入 序 列 大 約 只 有 40%-60% 間 ， 因 此 兩 序 列 屬 IS3 family 新 成 員 。 此 IS 廣 泛 分 佈 在 X. campestris 病 原 小 種 中， 包 括 台 灣 分 離 出 的 十 字 花 科 黑 腐 病 菌 X. c. pv. campestris ， 但 不 存 於 其 它 植 物 病 原 細 菌， 例 如 Pseudomonas syringae pv. apii, P. s. pv. tabaci, P. s. pv. glycinea, P. s. pv. coronafaciens, P. s. pv. atrofaciens 及 Erwinia spp. 如：E. amylovora, E. carotovora subsp. corotora, E. cypripedii, E. rhapontici 。 我 們 以 此 IS 為 遺 傳 標 記(genetic marker)， 分 析 黑 腐 病 菌 族 群 之 遺 傳 變 異 性， 發 現 族 群 中 至 少 有 四 個 異 質 群 體 (heterogeneous group)、 A, B, C, D 群 體，A 群 體 又 分 成 A1, A2, A3 type， 而 目 前 分 離 之 台 灣 的 黑 腐 病 菌族 群 屬 於A, B 群 體。 在 生 理 生 化 測 試 中 發 現， A, B, C, D 群 體 均 具 有 分 解 澱 粉 及 纖 維 素 之 能 力；另 外 測 試 碳 源 利 用 之 能 力 顯 示 有29 種 糖 類 A, B, C, D 群 體 均 可 代 謝 利 用，34 種 糖 類 均 不 可 被 代 謝 利 用。D 群 體 可 利 用 之 種 類 達 到 55 種 較 其 它 群 體 為 多； 另 外 各 別 菌 株 在 一 些 糖 類 間 其代 謝 的 能 力 亦 有 所 不 同。 病 原 性 測 試 中 發 現，測 試 中 A, B, C, D 群 體 之 菌 株 均 在 注 射 之 組 織 部 位 出 現 壞 死 現 象(necrosis), 有 些 菌 株 如 A3 type 之 XCC41, XCC14-1, XCC33-1, XCC36-1 最 先 看 到 輕 微 黃 化 現 象 (yellowing); A2 type 之 XCC1-1, A3 type 之 XCC33-1 及 B 群 體 之 XCC13-1 菌 株 經 連 續 接 種 3 次 後, 以 IS1404 為 探 針, 進 行 banding pattern 的 分 析 結 果, 發 現 並 無 變 化 的 情 形, 顯 示 病 原菌 之 IS1404 在 植 物 寄 主 中 沒 有 發 生 轉 位 現 象. 另 一 方 面, 我 們 分 別 將 A2 type 之 XCC1-1, A3 type 之 XCC14-1, XCC33-1 或 A2 type 之 XCC1-1, A3 type 之 XCC14-1, 及 B 群 體 之 XCC13-1 菌 株 之 混 合 菌 液 接 種 植 物,顯 示 B 群 體 之 XCC13-1 菌 株 在 寄 主 植 物 內 的 競 爭 能 力 優 於 A2 type 之 XCC1-1 及 A3 type 之 XCC14-1 菌 株. A repetitive sequences in Xanthomonas campestris pv. juglandis were identified as a new insertion sequences, IS1403, by nucleotide sequence analysis. A homologous IS, IS1404, was also cloned from X. c. pv. campestris. Both shared at least 91% identity on nucleotide level. The sequences were 1,203 bp in length with 42-bp terminal inverted repeat sequences, and flanked by 4-bp target site duplications. Comparison of target insertion sites flanking IS1403 and IS1404 elements revealed no similarities, and the G+C content of the flanking sequences of IS1403 is 45%, but that of IS1404 is 74%, indicating the elements transpose quite randomly and do not prefer A+T-rich regions. IS1403 and IS1404 contained two GTG-initiated open reading frames (ORFA and ORFB), and ORFB was in phase -1 relative to ORFA. The deduced amino acid sequences of ORFB contained the DD(35)E signature of IS3 putative transposase and retroviral integrase domain. There was A6G motif followed by a potential stem-loop structure between two reading frames, which may promote a -1 translational frameshift to produce a transframe protein (fusion protein ORFAB). Based on the features discussed, IS1403 and IS1404 were placed among the IS3 family with IS407 from Pseudomonas cepacia, IS476 from X. c. pv. vesicatoria, IS1222 from Enterobacter agglomerans, and ISR1 from Rhizobium lupini. The insertion sequences were widely distributed and existed in multiple copies in most pathovars of X. campestris, but other plant pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. apii, P. s. pv. tabaci, P. s. pv. glycinea, P. s. pv. coronafaciens, Erwinia amylovora, E. carotovora, and E. cypripedii, did not contain this insertion sequence based on Southern hybridization tests. At least 4 heterogeneous groups, A, B, C, D group, were found in X. c. pv. campestris (XCC) based on RFLP analysis using internal fragments of IS1404 as genetic markers. Group A was divided into A1, A2, A3 types. Strains isolated in Taiwan belonged to group A and B. These four group strains could hydrolyze starch and carboxymethyl cellulose. Carbon substrate utilization ability of different group strains were diverse. D group strain could use much more carbon substrates than other group strains. In the pathogenicity test, all tested strains of A, B, C, D groups first caused necrosis symptom in cabbage leaves, and later A3- type strains, such as XCC41, XCC14-1, XCC33-1 and XCC36-1, showed yellowing and black rot symptoms faster than other strains. IS1404 might be stable in host plants because A2-type strain (XCC1-1), A3-type strain (XCC33-1), and B group strain (XCC13-1) showed no changes in banding patterns after serial inoculation in cabbage. Only B group strain (XCC13-1) was recovered after serial inoculation tests with mixtures of three strains, A2-type strain (XCC1-1), A3-type strain (XCC14-1) and B group strain (XCC13-1), indicating that B group strain out- competed A group strains.