The solution conformation of the synthetic coiled coil 1A peptides of vimentin

• Main Authors: Lin,Kun Yi, 林昆儀
• Other Authors: Lyu, Ping Chiang
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Published: 1996
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/68386466497267781426

碩士 === 國立清華大學 === 生命科學研究所 === 84 === Vimentin是一種第三型中間絲蛋白(intermediate filament)，中間絲蛋 白為構成細胞骨骼的三種成分之一。過去的研究顯示出中間絲蛋白分子在 細胞歷經細胞分裂時，受到磷酸化酵素(kinase )的調控；藉由激酵素的 活化與否，以顯示於vimentin分子上的磷酸化部位與程度來決定vimentin 蛋白分子的組合(assembly)抑或去組合(disassembly)。各種中間絲蛋白 分子擁有類似之分子結構上的特性，一般都將其簡單地分為三部份：胺 端(N-termi-nal)頭部、羰端(C-terminal)尾部、以及一段約佔全部胺基 酸數目70﹪的桿狀雙纏螺旋(coiled coil)中段。比對人類、老鼠、牛、 豬與小雞的Vimentin蛋白質序列發現，其構成中段桿狀雙纏螺旋之序列擁 有超過 95﹪的相似性(homology)。我們的實驗方向，乃是應用結構生物 學的觀念與實驗技術，來瞭解vimentin蛋白質受熱時，其1A段雙纏螺旋結 構(coiled coil 1A)的二級結構變化。同時，我們特別設計了氧化的實驗 ，來驗證了此段peptide不需其他蛋白的協助，即具有形成同向雙聚體( parallel dimer)的能力。我們根據vimentin的第一A段雙纏螺旋部份合成 一段peptide，並且為了探討其分子特性--在形成二聚體時是否偏好同向( parallel)結合--又合成另外兩段peptide，其一在原合成peptide的胺端 加上 Cys-Gly-Gly-，另外一個則在羰端加上-Gly-Gly-Cys；藉助於HPLC 來追蹤氧化的狀況得以發現，vimentin的第1A段雙纏螺旋部份在形成二聚 體時應較偏好同向結合。旋光儀的升溫解構實驗(thermal denaturation) 亦驗證了我們對peptide設計的能力與對原peptide分子特性的掌握：第一 、已形成雙硫鍵結的peptide具有超過75﹪的螺旋度，相對於沒有雙硫鍵 結的 60﹪(peptide濃度約30mM，4℃ )；第二、沒有雙硫鍵結的peptide 其解構溫度(Tm)約在30℃左右，而形成雙硫鍵結的peptide不管在低濃 度(15mM)到高濃度(90mM)都在65℃以上。高鹽濃度滴定實驗則告訴了我們 本peptide的結構性主要依賴蛋白質疏水性核心(hydrophobic core)所貢 獻的疏水性作用力，分子側鏈形成的鹽橋(salt bridge)並非維持結構的 主要作用力。