液泡焦磷酸水解酵素中必要離胺酸參與受質接合之鑑定

• Main Authors: Lee, ien-Hsien, 李建賢
• Other Authors: Pan, ng-Long
• Format: Others
• Language: en_US
• Published: 2011
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/98498118564465670122

博士 === 國立清華大學 === 生物資訊與結構生物研究所 === 99 === 質子傳送焦磷酸水解酵素(簡稱H+-PPase; EC 3.6.1.1)，藉由水解焦磷酸(PPi)所產生的能量，來傳送質子，提高質膜兩側的電化學梯度差。這種獨特的質子幫浦普遍存在於高等植物的液泡膜，以及某些細菌、單細胞生物的內膜。經由蛋白質序列比對，在質子傳送焦磷酸水解酵素可以找到七個高度保留的離胺酸，而其中六個離胺酸位於蛋白質突出於細胞質的部分。為了瞭解離胺酸在質子傳送焦磷酸水解酵素中，所辦演的角色與功能，我們以綠豆液泡膜上的質子傳送焦磷酸水解酵素為研究對象，將位於細胞質部分的18個離胺酸，利用定點突變法，一一將其變為丙胺酸。高度保留的離胺酸被突變為丙胺酸後，這些突變使得質子傳送焦磷酸水解酵素的水解能力與質子傳送能力大大地減低；而透過離子效應的實驗，其數據顯示位置730的離胺酸與其輔因子，鎂離子，的接合位相當接近，此外位置694與695的離胺酸則參與在抑制因子，氟離子，的接合位上。異硫氰酸螢光素(fluorescein 5'-isothiocyanate, 簡稱FITC)，一種會與一級胺產生共價鍵結，而時常被用來標定蛋白質中的離胺酸的化學物質，已被知道能夠標定一個位於質子傳送焦磷酸水解酵素活化區的特定離胺酸。在化學修飾的實驗中，我們發現位於位置250處的突變株(K250A, K250N, K250T, K250S)，其水解焦磷酸的活性均無法被異硫氰酸螢光素所抑制，依據這一結果，我們推論位置250處的離胺酸處於受質的接合位上；且經由活性測試，這些突變株會導致耦合率下降，說明了位置250處的離胺酸亦與質子傳送效率有關。而透過胰蛋白酵素分解實驗，實驗結果顯示位置711與位置717的離胺酸，與酵素、受質形成的複合體穩定性有關，此外，此一實驗亦證明位置250處的離胺酸，正是胰蛋白酵素作用在質子傳送焦磷酸水解酵素上的重要切點，而此實驗結果亦可再次印證，位置250的離胺酸與酵素水解活性間的重要關係。我們依此建立一個活化中心結構模式，以解釋必要離胺酸在質子傳送焦磷酸水解酵素的角色。