| Summary: | Yersinia pseudotuberculosis appartient à la famille des Enterobacteriaceae et peut être responsable de syndromes articulaires et digestifs. Au cours de la colonisation de l’hôte, une minorité des bactéries va, en plus de l’étape de multiplication extracellulaire présenter une phase de réplication intracellulaire dans les macrophages. Une partie des Y. pseudotuberculosis va se répliquer dans les macrophages en usurpant la voie de l’autophagie, afin de créer une niche réplicative au sein des autophagosomes bloqués dans leur maturation. Le trafic membranaire associé à l’infection de Y. pseudotuberculosis reste à ce jour peu caractérisé. Dans un premier temps, nous avons observé que lors de l’infection d’une cellule épithéliale par Y. pseudotuberculosis, la vacuole bactérienne est associée avec le marqueur des autophagosomes, la protéine LC3 mais de façon surprenante cette vacuole ne présente pas deux mais une membrane unique. Par ailleurs, nous avons montré que les protéines SNARE jouent un rôle majeur au cours du trafic intracellulaire de Y. pseudotuberculosis. VAMP3 et VAMP7 sont recrutées de manière séquentielle au niveau de la vacuole de Y. pseudotuberuclosis. VAMP7 va participer au recrutement de LC3 au niveau de la vacuole bactérienne et nous proposons que VAMP3 est un des constituants du check-point permettant l’adressage de la bactérie vers des vacuoles présentant une ou de multiple membranes positives pour LC3. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des protéines de la voie autophagique et des endosomes, recrutées au niveau de la vacuole bactérienne à membrane unique et positive pour LC3. Nous avons mis en évidence que les protéines impliquées dans la formation de l’autophagosome et les marqueurs des endosomes précoces sont recrutées au niveau de la vacuole contenant Y. pseudotuberculosis. Cette vacuole positive pour LC3 va en suite acquérir les marqueurs des endosomes tardifs et du lysosome mais n’est pas acidifiée. En outre, nous avons initié des travaux sur un criblage en haut contenu afin d’identifier les partenaires des protéines SNARE et leurs rôles dans le trafic intracellulaire de Y. pseudotuberuclosis. Ces travaux démontrent l’importance de l’analyse de l’ultrastructure des compartiments positifs pour LC3. Ils illustrent comment la bactérie s’adapte à son environnement pour établir sa niche réplicative. Ils présentent enfin l’importance de la régulation de l’autophagie avec la première mise en évidence d’un check-point entre deux voies de compartimentation positives pour LC3 mais morphologiquement différentes. === Yersinia pseudotuberculosis is a member of the Enterobacteriaceae family. In human, Y. pseudotuberculosis infection is responsible for enteric and, in rare cases, erythema nodosum. During host colonization, a minor part of Y. pseudotuberculosis presents an intracellular replication step. Y. pseudotuberculosis can replicate inside macrophages by hijacking the autophagy pathway. The bacteria are able to block autophagosome maturation by acidification impairment, which allows to create a replicative niche. The membrane traffic during internalization of Yersinia remains poorly characterized. First, we highlighted that in epithelial cells, Y. pseudotuberculosis replicates mainly in vacuoles positive for LC3, a hallmark of autophagy. Surprisingly, this LC3-positive-vacuole presents only single limiting membrane. Second, we showed that SNARE proteins play a role in Y. pseudotuberculosis intracellular traffic. VAMP3 and VAMP7 are sequentially recruited to Yersinia-containing vacuoles (YCVs). VAMP7 is involved in the LC3 recruitment to YCVs with single- and double-membrane. We proposed that VAMP3 is a component of the molecular checkpoint for bacterial commitment to either single- or double-membrane LC3-positive pathway. Third, we characterized the traffic of endosomal proteins recruited to LC3-positive-YCV with single membrane in epithelial cells. We showed that markers of early endosome and proteins involved in autophagosome formation, are recruited to YCVs during the early stage of infection. Then, the vacuole acquire late endosomal and lysosomal proteins but acidification is not observed. Finally, we initiated a high-content screening approach for the identification of SNARE partners.Overall this work illustrates the importance of LC3-positive compartment ultrastructure analysis. Our result demonstrate how bacterial subvert the molecular machinery of the host in order to create a replicative niche. Finally, we present the importance of autophagy regulation by highlighting for the first times the existence of a molecular checkpoint between two LC3-positive vacuoles with different morphologies
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