Rôle du Ptdlns5P et de PIKfyve dans le contrôle de l'intégrité des granules plaquettaires

• Main Author: Mansour, Rana
• Other Authors: Toulouse 3
• Language: fr
• Published: 2016
• Subjects: Mégacaryocytes; Plaquettes; Granules; PtdIns5P; PIKfyve; Megakaryocytes; Platelets
• Online Access: http://www.theses.fr/2016TOU30089/document

Les plaquettes jouent un rôle primordial dans le processus d'hémostase. Elles sont générées à partir des mégacaryocytes (MK) présents dans la moelle osseuse. En plus des compartiments vésiculaires classiques de la voie d'endocytose et de dégradation vers les lysosomes, les plaquettes possèdent deux compartiments sécrétoires additionnels, les granules alpha et denses. Ces granules sont générés au cours de la maturation des MK à partir des corps multivésiculaires (MVB) et contiennent des molécules essentielles aux fonctions plaquettaires. Un défaut dans la production ou le remplissage de ces granules est à l'origine de symdromes hémorragiques. Malgré des études montrant l'implication de certaines protéines du trafic vésiculaire, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la biogenèse et la maintenance des granules plaquettaires dans les MK ainsi que les mécanismes de tri des cargos qu'ils contiennent, ne sont pas complètement élucidés. Au cours de ces dernières années les phosphoinositides (PI) sont apparus comme des acteurs majeurs du trafic vésiculaire en régulant de la localisation de certaines protéines. Cependant, peu de choses sont connues à ce jour quant au rôle de ces lipides dans la biogenèse et le trafic des granules plaquettaires dans les MK. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle d'un des membres de la famille des PI, le phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), ainsi que deux enzymes responsables de sa synthèse : la 3-phosphatase MTM1 (mutée dans la myopathie centronucléaire, CNM) et la lipide kinase PIKfyve, dans le contrôle de la dynamique des granules. Mes résultats montrent que MTM1 est présente dans les MK et les plaquettes et est localisée en partie sur les granules denses. Cependant, cette phosphatase n'est pas essentielle pour la production et l'activation plaquettaire. En effet, les souris MTM1 KO ne présentent pas de défaut du nombre plaquettaire, ni d'agrégation et de sécrétion suite à une stimulation par la thrombine ou le collagène. Nous montrons la présence d'autres membres de la famille des myotubularines dans les plaquettes et les MK différenciés, ce qui pourrait expliquer une redondance de fonction. De façon intéressante, nous montrons que la détection de MTM1 à partir de faible quantité de sang (<100 ?l) pourrait déboucher sur la mise au point d'un test diagnostic rapide pour la détection de la CNM. Mes travaux ont été focalisés par la suite sur PIKfyve. En utilisant la lignée leucémique mégacaryoblastique MEG-01 différenciée, je montre pour la première fois que le PtdIns5P est localisé dans les compartiments endosomes tardifs ainsi que dans les granules alpha et denses. Dans ces cellules, PIKfyve contrôle plus de 50% du PtdIns5P. De façon remarquable, l'inhibition pharmacologique de PIKfyve ou son invalidation par siRNA entraine une perte d'identité des granules avec la formation de granules élargis qui présentent à la fois des marqueurs de granules denses et alpha et bloque totalement leur mobilité. Ces données ont été confirmées dans des MK primaires de souris. L'addition de PtdIns5P exogène sur les MEG-01 restaure le phénotype normal des granules démontrant que PIKfyve, par l'intermédiaire du PtdIns5P, contrôle l'intégrité des granules qui est donc un phénomène actif et les mécanismes de fusion/fission des vésicules affectant le tri des cargos. De plus, l'inhibition de PIKfyve dans les plaquettes isolées affecte leur agrégation et leur sécrétion, montrant que PIKfyve et le PtdIns5P peuvent agir d'une part lors de la biogénèse des plaquettes dans les MK et d'autre part sur le fonctionnement des plaquettes. Dans leur ensemble, mes travaux placent PIKfyve et son produit lipidique, le PtdIns5P, comme des acteurs majeurs de la maintenance et l'identité des granules plaquettaires. === Platelets play a major role in homeostasis processes. They are generated from megakaryocytes (MKs) in the bone marrow. In addition to the classic vesicular compartments of the endocytic and degradation pathway toward lysosomes, platelets have two additional specialized secretory compartments, the dense and alpha granules. These granules are made during MK maturation from multivesicular bodies (MVB) and contain molecules that are essential to platelet functions. Defect in the production of these granules or absence of their cargos is the cause of hemorrhagic syndromes. Despite many studies showing the implication of vesicle trafficking proteins, the molecular mechanisms controlling the biogenesis and maintenance of the granules and cargo sorting are not completely understood. In recent years, phosphoinositides (PIs) have emerged as key actors in vesicular trafficking playing a role of important spatial regulators of many proteins. However, little is known about the role of these lipids in the biogenesis and the trafficking of platelet granules in the MK.During my thesis, I have studied the role of one the member of the PI family, the phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), and of two enzymes responsible of its synthesis : the 3-phosphatase MTM1(mutated in the Centronuclear myopathy, CNM) and the lipid kinase PIKfyve, in the control of granules dynamic. My results show that MTM1 is present in MK and platelet and that platelet MTM1 localizes in part on dense granules. However, the phosphatase is not mandatory for platelet production and activation. Indeed, the knock-out of MTM1 in mice has no effect on platelet count, aggregation and secretion following thrombin or collagen stimulation. We show the presence of other members of the myotubularins family in platelet and differentiated MK, which can explain a redundancy in functions. Interestingly, we show that MTM1 detection from small amount of blood (<100 ?l) could lead to the development of a rapid diagnostic test for the detection of the CNM. My work was next focalized on PIKfyve. Using the differentiated leukemic megakaryoblastic cell line MEG-01 as a cell model, I showed for the first time that PtdIns5P is localized on late endosome and on alpha and dense granules. In these cells, PIKfyve controls more than 50% of cellular PtdIns5P. Remarkably, pharmacological inhibition of PIKfyve or its invalidation by siRNA leads to a loss of granules identity with the formation of enlarged granules containing both alpha and dense granules markers, and totally blocks their mobility. These data were also confirmed on primary mice MK. Addition of exogenous PtdIns5P on MEG-01 cells restores the normal phenotype of granules showing that PIKfyve, via PtdIns5P, controls granules integrity, an active phenomenon, and the fusion/fission mechanisms that affect cargos sorting. Furthermore, PIKfyve inhibition in isolated platelet affects their aggregation and secretion, showing that PIKfyve and the PtdIns5P may act on the biogenesis of platelets in MK and also on the function of mature platelets. In conclusion, my Ph.D. work shows that PIKfyve and its product PtdIns5P are major actors in platelet granules maintenance and integrity.