Caractérisation structurale d'un complexe de défense bactérienne
De nos jours, la résistance aux antibiotiques développée par des pathogènes bactériens est de plus en plus répandue, et en conséquent il devient primordial de caractériser de nouvelles cibles bactériennes potentielles. Les alpha2-macroglobulines (α2Ms) sont des inhibiteurs de protéases à large spec...
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Infection Bacterie Biologie structurale Défense Infection Bacteria Structural biology Defense 570 Nedeljkovic, Marko Caractérisation structurale d'un complexe de défense bactérienne |
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De nos jours, la résistance aux antibiotiques développée par des pathogènes bactériens est de plus en plus répandue, et en conséquent il devient primordial de caractériser de nouvelles cibles bactériennes potentielles. Les alpha2-macroglobulines (α2Ms) sont des inhibiteurs de protéases à large spectre jouant un rôle clé dans l’immunité eucaryote. Ce sont des molécules multi domaines d’environ 1800 résidus qui arborent une séquence en acide nucléique très spécifique appellée « bait site » qui est reconnu et couper par un très grand nombre de protéases. Durant ce clivage, la nouvelle conformation de la protéine entraine l’exposition de la liaison thioester entre une cystéine et une glutamine, qui est alors hydrolysée, permettant ainsi au glutamate résultant de s’associer de façon covalente à la protéase cible, et d’être piégé dans la structure en forme de cage de α2M. Des homologues de a2M provenant de bactéries colonisées et pathogéniques ont récemment été caractérisés. Ces nouvelles recherches suggère que la bactérie dispose un système immunitaire capable de mimer les étapes clés initiales du système immunitaire eucaryote et que celui-ci pourrait constituer une cible encore inexploitée en biologie pathogène.On retrouve dans le génome bactérie deux types de gènes pour a2M: celui de type 1 qui contient la liaison thioester et celui de type 2 qui n’en dispose pas. De façon intéressante, le a2M bactérien de type 1 est situé de façon persistante dans le même opéron que le gène codant pour une enzyme de biosynthèse de la paroi cellulaire appelée Penicillin-binding Protein 1c (PBP1s). Cela suggère qu’une association étroite entre ces deux protéines pourrait être très avantageuse pour la cellule, spécialement durant l’infection et/ou la colonisation où la membrane cellulaire externe est ciblée par des agents de défense de l’hôte. Dans cette situation, A2M et PBP1C pourraient exercer les rôles de « gardiens du périplasme » avec PBP1C réparant les dommages causés au niveau du peptidoglycane et A2M traquant les protéases invasives.Le but de ce travail est donc de démontrer l’existence de ce complexe PBP1C/A2M et de caractériser cette interaction de façon structurelle et fonctionnelle. Dans ce sens, les deux protéines provenant d’E. Coli ont été étudiées, ainsi qu’exprimées et purifiées séparément. La protéine Α2M (également appelé ECAM dans E.Coli) est très soluble, exprimée de façon monomérique à une taille de 182kDa, monodispersée et stable dans l’échelle de temps. PBP1c est une protéine se fixant à la membrane, d’une taille de 87kDa et présente de façon prédominante en tant que dimère. La reconstitution du complexe in vitro par incubation et mélange des deux protéines pendant 2 heures a permis d’obtenir un complexe PBP1C/ECAM, dont la présence a été prouvée par un nouveau pic caractéristique sur chromatographie par exclusion de taille. Ces résultats ont également été appuyés par SDS-PAGE, centrifugation analytique et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). ECAM et PBP1c s’associent à des ratios stœchiométriques de 2/2 et 4:4. Enfin, un test d’activité a permis de confirmer tout d’abord le rôle de PBP1s dans la polymérisation les chaines glycanes mais aussi que cette activité est amplifiée en présence d’ECAM.Les essais cristallographiques ont permis d’obtenir des cristaux de PBP1c dans différentes conditions. De plus l'étude d’ECAM par microscopie électronique a prouvé que la technique était applicable pour des études structurelles du complexe. De ce fait, après optimisation, ces deux approches pourraient être la solution envisagée pour la caractérisation structurelle du complexe ECAM/PBP1c. === The widespread resistance to antibiotics developed by bacterial pathogens calls for the characterization of original, yet unexplored potential targets in bacteria. Alpha2-macroglobulins (α2Ms) are broad-spectrum protease inhibitors that play key roles in eukaryotic immunity. They are multi-domain molecules that carry approximately 1,800 residues and harbor a central amino acid sequence, the ‘bait site’, which is recognized and cleaved by a large number of proteases. Upon cleavage, the resulting conformational change exposes a buried thioester bond between a cysteine and a glutamine, which is readily hydrolyzed, allowing the resulting glutamate to associate covalently to the target protease, trapping it within the α2M cage-like structure. Recently, α2M homologs from pathogenic and colonizing bacteria have also started to be characterized. These findings suggest that bacteria possess a rudimentary immune system that mimics initial key steps of the eukaryotic immune pathway and that could represent a yet unexplored target in pathogen biology.The genes for two types of α2M are present in bacterial genomes: type 1, which contains the thioester bond, and type 2 that does not harbor it. Type 1 bacterial A2Ms persistently co-occur within the same operon with a gene that encodes a cell wall biosynthesis enzyme, Penicillin-Binding Protein 1c (PBP1c). This suggests that the association between the two proteins could be highly advantageous for the cell during infection/colonization, when the outer cell wall is targeted by host defenses. In this situation, A2M and PBP1c could exert the role of ‘guardians of the periplasm’, with PBP1c repairing damaged peptidoglycan, and A2M trapping invading proteases.The aim of this work was to demonstrate the existence of such complex and characterize this interaction structurally and functionally. For this purpose, α2M and PBP1c from E. coli were studied. The proteins were expressed and purified separately. α2M (also called ECAM in E. coli) is highly soluble, monomeric protein with a mass of 182 kDa, monodisperse and stable during the course of time. PBP1c is a membrane-bound, 87 kDa protein, predominantly present as a dimer. The complex reconstitution in vitro by mixing and incubating the proteins for 2 hours resulted in formation of a complex, demonstrated by appearance of a new peak in size exclusion chromatography. This result was further confirmed by SDS-PAGE, analytical centrifugation and small-angle x-ray scattering (SAXS) experiments. ECAM and PBP1c associated in 2:2 and 4:4 stoichiometries. The activity test confirmed that PBP1c performs polymerization of glycan chains and that its activity is enhanced in the presence of ECAM.Crystallization trials yielded crystals of PBP1c in several conditions. The study of ECAM by electron microscopy proved that this technique could be used for structural studies of the complex. Both approaches are under optimization, and combined, they could be employed for structural characterization of the ECAM-PBP1c complex. |
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Durant ce clivage, la nouvelle conformation de la protéine entraine l’exposition de la liaison thioester entre une cystéine et une glutamine, qui est alors hydrolysée, permettant ainsi au glutamate résultant de s’associer de façon covalente à la protéase cible, et d’être piégé dans la structure en forme de cage de α2M. Des homologues de a2M provenant de bactéries colonisées et pathogéniques ont récemment été caractérisés. Ces nouvelles recherches suggère que la bactérie dispose un système immunitaire capable de mimer les étapes clés initiales du système immunitaire eucaryote et que celui-ci pourrait constituer une cible encore inexploitée en biologie pathogène.On retrouve dans le génome bactérie deux types de gènes pour a2M: celui de type 1 qui contient la liaison thioester et celui de type 2 qui n’en dispose pas. De façon intéressante, le a2M bactérien de type 1 est situé de façon persistante dans le même opéron que le gène codant pour une enzyme de biosynthèse de la paroi cellulaire appelée Penicillin-binding Protein 1c (PBP1s). Cela suggère qu’une association étroite entre ces deux protéines pourrait être très avantageuse pour la cellule, spécialement durant l’infection et/ou la colonisation où la membrane cellulaire externe est ciblée par des agents de défense de l’hôte. Dans cette situation, A2M et PBP1C pourraient exercer les rôles de « gardiens du périplasme » avec PBP1C réparant les dommages causés au niveau du peptidoglycane et A2M traquant les protéases invasives.Le but de ce travail est donc de démontrer l’existence de ce complexe PBP1C/A2M et de caractériser cette interaction de façon structurelle et fonctionnelle. Dans ce sens, les deux protéines provenant d’E. Coli ont été étudiées, ainsi qu’exprimées et purifiées séparément. La protéine Α2M (également appelé ECAM dans E.Coli) est très soluble, exprimée de façon monomérique à une taille de 182kDa, monodispersée et stable dans l’échelle de temps. PBP1c est une protéine se fixant à la membrane, d’une taille de 87kDa et présente de façon prédominante en tant que dimère. La reconstitution du complexe in vitro par incubation et mélange des deux protéines pendant 2 heures a permis d’obtenir un complexe PBP1C/ECAM, dont la présence a été prouvée par un nouveau pic caractéristique sur chromatographie par exclusion de taille. Ces résultats ont également été appuyés par SDS-PAGE, centrifugation analytique et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). ECAM et PBP1c s’associent à des ratios stœchiométriques de 2/2 et 4:4. Enfin, un test d’activité a permis de confirmer tout d’abord le rôle de PBP1s dans la polymérisation les chaines glycanes mais aussi que cette activité est amplifiée en présence d’ECAM.Les essais cristallographiques ont permis d’obtenir des cristaux de PBP1c dans différentes conditions. De plus l'étude d’ECAM par microscopie électronique a prouvé que la technique était applicable pour des études structurelles du complexe. De ce fait, après optimisation, ces deux approches pourraient être la solution envisagée pour la caractérisation structurelle du complexe ECAM/PBP1c. The widespread resistance to antibiotics developed by bacterial pathogens calls for the characterization of original, yet unexplored potential targets in bacteria. Alpha2-macroglobulins (α2Ms) are broad-spectrum protease inhibitors that play key roles in eukaryotic immunity. They are multi-domain molecules that carry approximately 1,800 residues and harbor a central amino acid sequence, the ‘bait site’, which is recognized and cleaved by a large number of proteases. Upon cleavage, the resulting conformational change exposes a buried thioester bond between a cysteine and a glutamine, which is readily hydrolyzed, allowing the resulting glutamate to associate covalently to the target protease, trapping it within the α2M cage-like structure. Recently, α2M homologs from pathogenic and colonizing bacteria have also started to be characterized. These findings suggest that bacteria possess a rudimentary immune system that mimics initial key steps of the eukaryotic immune pathway and that could represent a yet unexplored target in pathogen biology.The genes for two types of α2M are present in bacterial genomes: type 1, which contains the thioester bond, and type 2 that does not harbor it. Type 1 bacterial A2Ms persistently co-occur within the same operon with a gene that encodes a cell wall biosynthesis enzyme, Penicillin-Binding Protein 1c (PBP1c). This suggests that the association between the two proteins could be highly advantageous for the cell during infection/colonization, when the outer cell wall is targeted by host defenses. In this situation, A2M and PBP1c could exert the role of ‘guardians of the periplasm’, with PBP1c repairing damaged peptidoglycan, and A2M trapping invading proteases.The aim of this work was to demonstrate the existence of such complex and characterize this interaction structurally and functionally. For this purpose, α2M and PBP1c from E. coli were studied. The proteins were expressed and purified separately. α2M (also called ECAM in E. coli) is highly soluble, monomeric protein with a mass of 182 kDa, monodisperse and stable during the course of time. PBP1c is a membrane-bound, 87 kDa protein, predominantly present as a dimer. The complex reconstitution in vitro by mixing and incubating the proteins for 2 hours resulted in formation of a complex, demonstrated by appearance of a new peak in size exclusion chromatography. This result was further confirmed by SDS-PAGE, analytical centrifugation and small-angle x-ray scattering (SAXS) experiments. ECAM and PBP1c associated in 2:2 and 4:4 stoichiometries. The activity test confirmed that PBP1c performs polymerization of glycan chains and that its activity is enhanced in the presence of ECAM.Crystallization trials yielded crystals of PBP1c in several conditions. The study of ECAM by electron microscopy proved that this technique could be used for structural studies of the complex. Both approaches are under optimization, and combined, they could be employed for structural characterization of the ECAM-PBP1c complex. Electronic Thesis or Dissertation Text en http://www.theses.fr/2017GREAV067 Nedeljkovic, Marko 2017-12-21 Grenoble Alpes Dessen, Andréa |