Molekularbiologische Charakterisierung von nicht-kultivierten Crenarchaeota und Acidobacteria in Metagenombanken aus Bodenproben

• Main Author: Quaiser, Achim
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2003
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/368/1/DissertationAQ2kompl2.pdf; Quaiser, Achim <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Quaiser=3AAchim=3A=3A.html> (2003): Molekularbiologische Charakterisierung von nicht-kultivierten Crenarchaeota und Acidobacteria in Metagenombanken aus Bodenproben.Darmstadt, Technische Universität, [Online-Edition: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000368 <http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000368> <official_url>],[Ph.D. Thesis]

Molekular-phylogenetische Studien, basierend auf der Charakterisierung von 16S rRNA-Genen, haben gezeigt, dass Bodenhabitate besonders reich an mikrobieller Diversität sind. So wurde z.B. eine bestimmte Gruppe der Crenarchaeota (Archaea), die bislang als Extremophile galten, durch 16S rDNA-Studien häufig in Bodenhabitaten entdeckt. Weiterhin konnte das Phylum der Acidobacteria, das derzeit von ca. 200 16S rDNA Umwelt-Sequenzen und von nur 3 kultivierten Vertretern repräsentiert wird, definiert werden. Es ist aufgrund seiner phylogenetischen Breite mit den Proteobacteria vergleichbar. Acidobacteria stellen häufig eine dominierende Fraktion der Mikroorganismen in Bodenhabitaten dar, sind jedoch bis heute ebenso wie die mesophilen Crenarchaeota weitgehend uncharakterisiert. Aus Mangel an geeigneten Techniken bleiben bislang insgesamt mehr als 99% der Mikroorganismen in den meisten Habitaten uncharakterisiert, weil sie nicht im Labor kultiviert werden können. Inspiriert von den schnellen Fortschritten der mikrobiellen Genomik wurde in dieser Arbeit die Strategie der Umweltgenomik auf Bodenhabitate angewendet, um erstmals mesophile, unkultivierte Crenarchaeota und Acidobacteria aus Böden zu charakterisieren. Voraussetzung dafür war die direkte Isolierung von hochmolekularer DNA aus Bodenproben, die aufgrund des Vorliegens von grossen Mengen an polyphenolischen Komponenten (Humin- und Fulvinsäuren) eine besondere Herausforderung darstellte. Es wurde eine Methodik entwickelt, die auf einer 2-phasigen Gelelektrophoresetechnik basierte, und die eine schnelle und reproduzierbare Isolierung von klonierbarer, hochmolekularer DNA aus unterschiedlichen Habitaten erlaubte. Von diesen Nukleinsäuren wurden komplexe Genbibliotheken mit großen Inserts konstruiert. Die Charakterisierung der Genbibliotheken zeigte, dass die in den Habitaten durch PCR-Studien dargestellte große mikrobielle Diversität tatsächlich auf genomischer Ebene ab-gebildet werden konnte. Mit Archaea-spezifischen und Acidobacteria-spezifischen Sonden wurden je ein Genomfragment der mesophilen nicht-kultivierten Crenarchaeota und der Acidobacteria aus einer 960 Mbp großen Fosmid-Genbank einer Bodenprobe isoliert und charakterisiert. Der archaeale Klon enthielt ein 34 kb Fragment, auf dem ein komplettes rRNA-Operon und 17 Protein-kodierende Gene lokalisiert waren. Die phylogenetischen Analysen der rRNA-Gene und eines Proteingens bestätigten die Zugehörigkeit des Genomfragments zur Gruppe der nicht-thermophilen Crenarchaeota. Die Genomstruktur und die auf dem Genomfragment lokalisierten Gene zeigten deutliche Unterschiede zu den bereits untersuchten, nahe-verwandten marinen Vertretern. Die detaillierte Analyse eines 35 kb Fragments der Acidobacteria bestätigte die Zugehörigkeit des Genomfragmentes zu dieser noch unbeschriebenen, ökologisch aber relevanten Gruppe. Durch vergleichende Genomanalysen und phylogenetische Rekonstruktionen wurden Hinweise auf einen horizontalen Gentransfer zwischen Rhizobiaceae (a-Proteobacteria) und Acidobacteria erhalten. Ein Bereich, der 10 kb mit 8 potentiellen Protein-kodierenden Genen überspannte, war colinear und zeigte große Sequenzähnlichkeiten mit einem Genombereich von Rhodopseudomonas palustris. Die Charakterisierung der Protein-kodierenden Gene ermöglichte erste Einblicke in das physiologische Potential der mesophilen Crenarchaeota und der Acidobacteria und stellt eine Basis für weiterführende genomische Untersuchungen dar.