DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem

• Main Author: Krasnyanska, Julia
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2014
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/4081/1/Dissertation_Julia%20Krasnyanska.pdf; Krasnyanska, Julia <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Krasnyanska=3AJulia=3A=3A.html> (2014): DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des Beitrags der zur Verfügung stehenden Wege und deren Regulation bei der Reparatur der strahleninduzierten DNADoppelstrangbrüche (DSBs) im DT40‐Zellsystem. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen der beiden klassischen DNA‐Doppelstrangbruch‐Reparaturwege, c‐NHEJ (canonical non‐homologous end‐joining) und HR (homologous recombination) durch den Zellzyklus untersucht. Anhand von WT und Reparaturmutanten, die einen Defekt im c‐NHEJ (Ku70‐/‐) bzw. in der HR (Rad54‐/‐) oder in beiden Reparaturwegen (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) aufweisen,wurden das klonogene Überleben und die Reparatur genauer analysiert. Mithilfe der Überlebensexperimente mit exponentiell wachsenden Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen der Doppelmutante (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) die strahlenempfindlichste Zelllinie darstellen,was die Wichtigkeit der beiden Reparaturwege für das Überleben nach ionisierender Strahlung unterstreicht. Die Zellen der HR‐Mutante (Rad54‐/‐) zeigten eine moderate Strahlenempfindlichkeit.Interessanterweise wies die Überlebenskurve der c‐NHEJ‐Mutante (Ku70‐/‐) ein biphasisches Verhalten auf, welches sich bei niedrigen Dosen (bis 2 Gy) in einer Strahlensensitivität, bei höheren Strahlendosen (4‐10 Gy) jedoch in einer Strahlenresistenz gegenüber dem WT äußerte. Die in dieser Arbeit etablierte Messung der Zellzyklusphasenabhängigen Reparatur in DT40‐Zellen unterstützte nur partiell das aus dem Säugetierzellsystem bekannte Reparaturmodell und das biphasische Verhalten der Ku70‐/‐‐Mutante im Überlebensexperiment. Analysen der γH2AX‐Foci zeigten, dass auch im DT40‐Zellsystem das c‐NHEJ der dominante Weg für die in der G1‐Phase bestrahlten Zellen ist. Die Reparaturstudien der in der G2‐Phase bestrahlten Zellen verdeutlichen, dass trotz der hohen HR‐Frequenz in den DT40‐Zellen, das c‐NHEJ den größeren Anteil an DSBs als der Vorgang der HR beseitigt.Um einen genaueren Einblick in den Beitrag der jeweiligen Reparaturwege nach Bestrahlung in der S‐Phase zu gewinnen, wurden S‐Phase Zellen anhand spezifischer EdU-Muster in drei Untergruppen (frühe, mittlere und späte S) unterteilt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der frühen S‐Phase bestrahlten Zellen das c‐NHEJ bevorzugt nutzen, während für die in der mittleren und späten S‐Phase bestrahlte Zellen die HR der dominierende Schritt in der Reparatur ist. Aufgrund der verbesserten Reparatur der in der mittleren SPhase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante im Vergleich zum WT, wurde angenommen,dass das c‐NHEJ für diese Zellzyklusphase keine Rolle spielt. Aufgrund der Restreparatur in der Doppelmutante konnte der Einfluss eines zusätzlichen Reparaturweges wie eines A‐EJ (alternative end‐joinig)‐Mechanismus in den DT40‐Zellen nicht ausgeschlossen werden. Die Reparaturstudien ließen vermuten, dass die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante aufgrund ihres gegenüber dem WT vorhandenen Reparaturvorteils zur verbesserten Überlebensfähigkeit beitragen. Für die Überprüfung dieser Annahme wurden die Zellzyklusphasen‐spezifische Überlebensfähigkeit und die Reparaturmessungen in synchronisierten Zellen betrachtet. Aus diesem Experiment wurde ersichtlich, dass die in der späten S/G2‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante trotz eines Reparaturdefektes eine besserere Überlebensfähigkeit als der WT aufweisen. Die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante zeigen dagegen trotz des Reparaturvorteils eine im Vergleich zum WT deutlich niedrigere Überlebensrate. Diese sich widersprechenden Ergebnisse weisen daraufhin, dass die Qualität der Reparatur ein entscheidender Faktor für die Überlebensfähigkeit der Zelle ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion des Proteins Artemis während der DSB-Reparatur genauer untersucht. Aus Studien mit Säugetierzellen ist bekannt, dass Artemis-defiziente Zellen empfindlich auf Strahlung reagieren und dass Artemis zusammen mit ATM an der langsamen Reparaturkomponente von strahleninduzierten DSBs sowohl in der G1‐ als auch in der G2‐Phase beteiligt ist. In der G1‐Phase beteiligt sich Artemis am c‐NHEJ. In der G2‐Phase ist es während der HR für die Reparatur heterochromatischer DSBs verantwortlich. In den Überlebensexperimenten mit DT40‐Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Artemis‐defiziente Zelllinien strahlenempfindlich sind. Mithilfe der γH2AX‐Foci‐Analyse wurde festgestellt, dass Artemis während der Reparatur nach Bestrahlung in der G1, G2,sowie in der frühen und der späten S‐Phase wichtig ist. Dagegen läuft die Reparatur der in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen in der Abwesenheit von Artemis schneller als im WT ab, was die chromosomalen Studien ebenfalls unterstützen. Die Reparatur in den Ku70‐/‐/Art‐/‐‐ sowie Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutanten verläuft nahezu in allen Zellzyklusphasen besser als in den Ku70‐/‐‐ und Rad54‐/‐‐Einzelmutanten. Die Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutante bildet jedoch in der G1‐Phase einen mit der Art‐/‐‐defizienten Zelllinie vergleichbaren Reparaturdefekt aus. Das Aufheben der Reparaturdefekte in der c‐NHEJ‐ und HR‐Mutante durch die Artemis‐Deletion deutet daraufhin, dass die DSBs ungehindert über alternative Mechanismen repariert werden. Diese werden insbesondere aktiviert, wenn klassische Reparaturwege fehlen. Somit scheint Artemis eine neue Funktion auszuführen, indem es als ein molekularer Schalter die Wahl der Reparaturwege, c‐NHEJ, HR und A‐EJ‐Mechanismen regelt.