Bedeutung von Interleukin-10 für die Funktionalität von NK-Zellen und ihre Wechselwirkung mit umgebenden Immunzellen

• Main Author: Waldmann, Anja
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2018
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8182/1/AnjaWaldmann%20Dissertation%202018.pdf; Waldmann, Anja <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Waldmann=3AAnja=3A=3A.html> (2018): Bedeutung von Interleukin-10 für die Funktionalität von NK-Zellen und ihre Wechselwirkung mit umgebenden Immunzellen.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) repräsentieren einen wichtigen Effektorzelltyp in der adoptiven Krebs-Immuntherapie, da sie imstande sind, maligne Zellen direkt zu eliminieren und die Tumor-spezifische adaptive Immunantwort zu regulieren. Als allogenes Zell-therapeutikum kommt in experimentellen Ansätzen neben primären Spender-NK-Zellen auch die humane NK-Zelllinie NK-92 zum Einsatz. NK-92 Zellen können in vitro unter GMP-Bedingungen gut expandiert und genetisch modifiziert werden. Da die natürliche Zytotoxizität dieser Zellen gegenüber Krebszellen von soliden Tumoren begrenzt ist, wurden NK-92 Zellen mit chimären Antigenrezeptoren (CARs) ausgestattet, wodurch sie definierte Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen erkennen und Antigen-positive Zellen effizient abtöten können. Eine in dieser Arbeitsgruppe generierte CAR NK-92 Zelllinie ist NK-92/5.28.z, welche gegen das Tumor-assoziierte Antigen ErbB2 gerichtet ist und in präklinischen Tierexperimenten zur Abstoßung ErbB2-exprimierender Tumoren führte. Außerdem induzierte die Behandlung mit NK-92/5.28.z Zellen in immunkompetenten Mäusen einen immunologischen Langzeitschutz gegen das Auswachsen erneut injizierter Tumorzellen. Eine mögliche Erklärung dafür ist die Beeinflussung der Aktivität von endogenen Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung durch die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine durch aktivierte NK-Zellen. In vitro Experimente haben gezeigt, dass CAR NK-92 Zellen nach Kontakt mit Antigen-positiven Tumorzellen große Mengen pro-inflammatorischer Zytokine wie IFN-γ sekretieren. Interessanterweise sezernieren aktivierte CAR NK-92 Zellen jedoch auch das immunregulatorische Zytokin Interleukin (IL)-10. Hierbei handelt es sich um ein Zytokin mit pleiotropen Effekten, das von diversen Immunzellen ausgeschüttet wird. Grundsätzlich kann IL-10 pro-inflammatorischen Zytokinen entgegenwirken und die endogene Anti-Tumor-Antwort dämpfen. Allerdings ist IL 10 auch in der Lage, die Zytotoxizität von T-Zellen und NK-Zellen zu steigern. So ist in der derzeitigen Literatur die Bedeutung des von NK-Zellen sekretierten IL-10 für NK-Zellen selbst und für umgebende Immunzellen nicht eindeutig geklärt. Daher war das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von IL-10 auf das Wachstum und die Funktion von NK-Zellen und auf deren Interaktion mit anderen Immunzellen besser zu verstehen. Im Fokus der Untersuchungen standen die kontinuierlich expandierbare NK-Zelllinie NK-92 sowie die davon abgeleitete CAR-Effektorzelllinie NK-92/5.28.z als klinisch relevante Modelle für die adoptive Immuntherapie. Nach Aktivierung von parentalen und ErbB2-spezifischen NK-92 Zellen zeigte sich eine erhöhte IL-10 Expression auf mRNA- und Protein-Ebene, was frühere Ergebnisse der Arbeitsgruppe bestätigte. Zudem wurde die Expression des Rezeptors IL-10Rα auf NK-92 Zellen und CAR NK-92/5.28.z Zellen nachgewiesen, sodass endogen produziertes IL-10 autokrin auf die Zellen zurückwirken kann. Im Folgenden wurden Ansätze zur Hemmung der Produktion und biologischen Aktivität des von NK-92 Zellen sekretierten IL-10 untersucht. So wurde ein rekombinanter anti-IL-10 Mini-Antikörper mit vier Bindestellen generiert, der die Aktivität von löslichem IL-10 neutralisierte. Zudem wurden Ansätze erprobt, die die IL-10 Expression oder Sekretion in NK-92 Zellen unterbinden. Dazu zählten die shRNA-vermittelte Herunterregulation der IL-10 Expression auf mRNA-Ebene, ein CRISPR/Cas9-vermittelter IL 10 Gen-knockout auf DNA-Ebene und schlussendlich eine Hemmung der IL-10 Sekretion auf Protein-Ebene mittels intrazellulär exprimierter anti-IL-10 scFv-Antikörper (Intrabodies). Hierzu wurden scFv-Antikörpermoleküle konstruiert, die in den extrazellulären Raum sekretiert werden (αIL-10S), auf der Zelloberfläche lokalisiert sind (αIL-10TM) oder durch eine zusätzliche KDEL-Sequenz am C-Terminus im Lumen des endoplasmatischen Retikulums zurückgehalten werden, um dadurch die Sekretion von IL-10 zu unterdrücken (αIL-10ER). Die untersuchten Strategien zeigten sich alle in NK-92 Zellen funktional, führten jedoch zu einer im Ausmaß unterschiedlichen Reduktion der IL-10 Expression. In Bezug auf die Reduktion der IL-10 Sekretion erwiesen sich insbesondere die Gen-Editierung mit CRISPR/Cas9 und die Expression von αIL-10ER Intrabodies als gleichermaßen hoch effektiv. Es zeigte sich, dass eine reduzierte IL-10 Expression oder Sekretion die Proliferation, die natürliche und CAR-vermittelte spezifische Zytotoxizität der NK-Zellen und die Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IFN-γ und MIP-1α nicht beeinflusste. Ein für die Funktionalität von NK-92 Zellen entscheidender Beitrag von endogen produziertem IL-10 kann daher ausgeschlossen werden. Allerdings bewirkte die Verminderung oder vollständige Eliminierung der IL-10 Expression in NK-92/5.28.z Zellen je nach gewähltem Ansatz eine unterschiedliche Erhöhung der TNF-α Sekretion. Um zu untersuchen, ob das von aktivierten CAR NK-92 Zellen sezernierte IL-10 einen Einfluss auf den Phänotyp umgebender Antigen-präsentierender Zellen hat, wurden Transwell-Experimente mit Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen und Makrophagen durchgeführt. Die löslichen Faktoren aktivierter NK-92/5.28.z Zellen leiteten dabei die Reifung dendritischer Zellen ein, wobei dieser Prozess durch eine IL-10 Depletion in CAR NK-92 Zellen weiter gefördert wurde. Ohne Beeinflussung der IL-10 Produktion induzierten die sekretierten Botenstoffe aktivierter NK-92/5.28.z Zellen die Polarisierung von Makrophagen hin zu einem M2-Phänotyp, welcher in der Tumorprogression involviert ist. Wurde die Aktivität des von aktivierten NK-92/5.28.z Zellen sekretierten IL-10 dagegen neutralisiert oder seine Sekretion unterbunden, begünstigte dies die Ausprägung eines M1-ähnlichen Phänotyps. Diese Makrophagen-Population weist in der Regel antitumorale Eigenschaften auf. Entsprechend könnten diese Effekte die therapeutische Wirkung IL-10-depletierter NK-92/5.28.z Zellen in vivo durch eine verbesserte Aktivierung endogener Immunzellen steigern. Um die Anti-Tumor-Aktivität IL-10-depletierter NK-92/5.28.z Zellen in vivo zu untersuchen, wurde ein immun-kompetentes Mausmodell mit ErbB2-überexprimierenden B16-F10 Melanomzellen in C57BL/6N Albino Mäusen etabliert. Die Behandlung subkutan verabreichter B16-F10/ErbB2 Tumorzellen mit unmodifizierten oder IL-10-depletierten NK-92/5.28.z Zellen verlängerte dabei das Überleben der Mäuse im Vergleich zu Kontroll-Tieren, die mit parentalen NK-92 Zellen oder Puffer behandelt wurden. Allerdings wurde keine Langzeit-Regression der Tumoren der behandelten Tiere durch die Injektion von CAR NK-92 Zellen erzielt. Zudem waren die Überlebenskurven der mit unmodifizierten oder IL-10-depletierten NK-92/5.28.z Zellen therapierten Behandlungsgruppen nicht signifikant verschieden. Eine mögliche Erklärung für den fehlenden Langzeiteffekt der Behandlung könnte sein, dass B16-F10/ErbB2 Zellen nur sehr geringe Mengen an MHC-Klasse I exprimieren und damit einem Angriff zytotoxischer CD8+ T-Zellen entgehen können. Wie in einem unabhängigen in vitro Versuch gezeigt wurde, induziert zwar murines IFN-γ, nicht aber das von NK-92 Zellen sezernierte humane IFN-γ die Expression von MHC-Klasse I auf B16-F10/ErbB2 Zellen. Entsprechend ist davon auszugehen, dass das humane IFN-γ auch in vivo keinen Einfluss auf die murinen Tumor- und Immunzellen ausübt. So könnte aufgrund der fehlenden Aktivität des ausgeschütteten humanen IFN-γ die Hemmung der IL-10 Sekretion in NK-92/5.28.z Zellen keinen entscheidenden Beitrag zur Induktion einer anhaltenden endogenen Anti-Tumor-Immunantwort leisten. Die im Tiermodell erhaltenen Daten verdeutlichen jedoch, dass die Hemmung der IL-10 Sekretion in NK-92/5.28.z Zellen zumindest keinen negativen Einfluss auf den Therapieerfolg hatte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Hemmung der IL-10 Expression in NK-92 Zellen oder die Neutralisierung der IL-10 Aktivität die wesentlichen Funktionen dieser NK-Zellen nicht beeinträchtigt, aber den Phänotyp umgebender Immunzellen in Richtung einer verbesserten antitumoralen Aktivität beeinflussen kann. Ob dies auch eine Steigerung der Anti-Tumor-Immunantwort im Kontext eines lebenden Organismus bedingt, muss in weiterführenden in vivo Studien untersucht werden.