Reversible Dissoziation der V-ATPase bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae

• Main Author: Albertmelcher, Andrea
• Other Authors: Prof. Dr. Helmut Wieczorek
• Format: Doctoral Thesis
• Language: German
• Published: 2010
• Subjects: V-ATPase; Saccharomyces cerevisiae; Dissoziation; Regulation; ddc:570
• Online Access: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-201009146479

V-ATPasen kommen bei Saccharomyces cerevisiae in den Membranen der Vakuole und des Golgiapparats vor. Durch ihre Aktivität wird das Lumen dieser Organellen, wenn auch in unterschiedlichem Maße, angesäuert. Da die V-ATPase ATP verbraucht, erscheint eine strikte Regulierung der Enzymaktivität unter Hungerbedingungen zwingend notwendig. Der Hauptregulationsmechanismus zur Deaktivierung der V-ATPase ist die reversible Dissoziation. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden einige Faktoren hinsichtlich ihrer Beteiligung an der reversiblen Dissoziation der V-ATPase durch in vivo Beobachtungen an einzelnen Hefezellen untersucht. Fluoreszenzmikroskopische Beobachtungen unter in vivo-Bedingungen zeigten, dass nur die V1-Untereinheit C dem Mechanismus der reversiblen Dissoziation unterliegt und nicht, wie bisher angenommen, der gesamte V1-Komplex. Die restlichen V1-Untereinheiten verbleiben weiterhin an oder in der Nähe der Vakuolenmembran. Durch Depolymerisierung des Zytoskeletts zeigte sich eine Beteiligung der Mikrotubuli an der Dissoziation, während Aktin keinen Einfluss auf die reversible Dissoziation der Untereinheit C hatte. Mit Hilfe von Overlayblots und Co-Pelletierungsversuchen konnte eine direkte Interaktion der Untereinheit C mit den Mikrotubuli nachgewiesen werden. Fluoreszenzmikroskopische Lokalisationsstudien der Untereinheit C erbrachten bei Behandlung der Zellen mit unterschiedlichen Agenzien den Beweis, dass für die Dissoziation der Untereinheit C die V-ATPase nicht nur aktiv sein, sondern dass auch das intrazelluläre Lumen der Vakuole einen sauren pH-Wert haben muss. Die Reassoziation erfolgt jedoch unabhängig von diesen Faktoren. Ein anscheinend weiterer wichtiger Faktor bei der reversiblen Dissoziation der Untereinheit C ist der cAMP-PKA-Signalweg. Es konnte gezeigt werden, dass der Glucosesensor Gpr1 dabei keine Rolle spielt, während die Deletion der PKA Isoformen die Dissoziation von C inhibiert. Eine überaktive PKA durch Deletion der regulatorischen Untereinheit Bcy1 hatte hingegen eine Inaktivierung der V-ATPase zur Folge, was zum Verlust der Dissoziationsfähigkeit führte. Die Behandlung mit dem PKA Inhibitor H89 erbrachte den Nachweis, dass die PKA für die Reassoziation der Untereinheit C nicht gebraucht wird. Eine Phosphorylierung der Untereinheit C im Holoenzym durch die PKA zur Initiierung der Dissoziation scheint jedoch unwahrscheinlich. Stattdessen ist eine indirekte Beteiligung der PKA durch Regulierung von Stoffwechselwegen wahrscheinlicher, nachdem durch die TAP-Reinigung Enzyme der Glykolyse als Interaktionspartner von C gefunden wurden. Alle in der vorliegenden Arbeit gefundenen Faktoren spielen anscheinend eine Rolle bei der Dissoziation, nicht aber bei der Reassoziation. Im Gegensatz dazu ergab die Deletion des RAVE-Komplexes einen ersten Hinweis für eine Beteiligung an der Reassoziation bzw. Assemblierung, da Untereinheit C in diesem Stamm eine zytoplasmatische Lokalisation zeigte und die anderen V1-Untereinheiten eine Lokalisation an der Vakuole und im Zytoplasma.