Untersuchung der Anwendbarkeit von siRNA als antivirales Agens zur Inhibition der Replikation von Masernviren

• Main Author: Reuter, Thorsten
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2006
• Subjects: Masernvirus; RNS-Interferenz; Viruzid; ddc:570
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/1615; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18766; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18766; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/1615/Reuter_Doktorarbeit.pdf

Im Gegensatz zu genetisch modifizierten Viren ermöglicht der Einsatz von siRNA zur RNA Interferenz (RNAi) die post-transkriptionelle Inhibition der Gen-Expression zur Analyse von Infektionen mit völlig identischen Viren. Mittels RNase-III hergestellter siRNA wurde die Expression der sechs Masernvirus Gene unterbunden. Ist die siRNA gegen das Nukleokapsid (N)-, das Phospho (P)- oder gegen das Large (L)- Protein gerichtet, kommt es zur effektiven Einschränkung der Replikation und der generellen Gen-Expression. Diese drei Proteine sind für Transkription und Replikation essentiell, da die Genprodukte dieser drei Proteine die RNA-abhängige RNA Polymerase und den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) bilden. SiRNA gegen das Fusionsprotein (F) und das Hämagglutinin (H) schränken das Ausmaß der Zell-Zell Fusion ein. Interessanterweise führt die Inhibition der Expression des Matrix-Proteins (M) nicht nur zu einer Verstärkung der fusogenen Aktivität, sondern erhöht gleichzeitig die Expression der übrigen viralen mRNA und genomischer RNA um den Faktor 2-2,5, so dass das Verhältnis mRNA:Genom konstant bleibt. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass M als negativer Regulator der viralen Polymeraseaktivität wirkt, und sowohl die Produktion von mRNA wie auch die Genom- Replikation in gleichem Maß beeinflusst. Anschließend wurden synthetische siRNAs gegen die L-mRNA gesucht. Effektive Sequenzen wurden dann, in Form einer shRNA Expressionskassette, in einen lentiviralen Vektor einkloniert. Damit sollen dann lentivirale Partikel hergestellt werden, mit denen Zellen infiziert werden können, so dass diese Zellen dann stabil siRNA exprimieren. Dieser Teil der Arbeit war zum Zeitpunkt der Niederschrift noch nicht beendet. === In contrast to studies with genetically modified viruses, RNA interference (RNAi) allows the analysis of virus-infections with identical viruses and posttranscriptional ablation of individual gene functions. Using RNaseIII-generated multiple short interfering RNA (siRNA) against the six measles virus (MV) genes, we found efficient downregulation of viral gene expression in general with siRNAs against the nucleocapsid (N)-, phosphoprotein (P)-, and polymerase (L)-mRNAs, the translation products of which are forming the ribonucleoprotein (RNP) complex. Silencing of the RNP-mRNAs was highly efficient in reducing viral messenger and genomic RNAs. SiRNAs against the mRNAs for the haemagglutinin (H)- and 72 fusion (F) proteins reduced the extent of cell-cell fusion. Interestingly, siRNA-mediated knockdown of the matrix (M) protein not only enhanced cell-cell fusion, but also increased the levels of both, mRNAs and genomic RNA by a factor of 2 to 2.5, so that the genome to mRNA-ratio was constant. These findings indicate that M acts as a negative regulator of the viral polymerase activity, affecting mRNA transcription and genome replication to the same extent. In addition, two synthetic siRNA targetting the L-mRNA, were identified. These two sequences were cloned into a shRNA expressing lentiviral vector, which can then be used to produce pseudotyped lentiviral particels. Cells infected with these viral particles will express the siRNA continousely. This work was not finished when this thesis was written.