Dissecting the role of CENP-E in the maintenance of chromosome alignment

• Main Author: Filipe Fernandes de Sousa
• Other Authors: Faculdade de Medicina
• Format: Others
• Language: English
• Published: 2020
• Subjects: Ciências médicas e da saúde; Medical and Health sciences
• Online Access: https://hdl.handle.net/10216/114286

O objetivo da mitose é garantir a correta segregação dos cromossomas de modo a originar duas células geneticamente iguais. Quando as células entram em mitose, os seus cromossomas condensam e estabelecem ligações com o fuso mitótico através dos seus cinetocóros de modo a serem dirigidos para o equador da célula. Este processo de alinhamento é um pré-requisito para a correta segregação dos cromossomas, pois erros neste processo resultam em aneuploidia e Instabilidade Cromossómica (CIN). Uma das moléculas chave neste processo de alinhamento é a CENP-E, uma proteína motora pertencente à família das Cinesinas e que se acumula nos cinetocóros durante a mitose. Apesar de estar estabelecida a função desta proteína no processo de alinhamento dos cromossomas, a sua importância para manutenção desse alinhamento é desconhecida. Com a objetivo de a elucidar, foi determinada a dose óptima de inibição de CENP-E em linhas celulares humanas com e sem CIN, usando para tal três inibidores independentes: PF-2771, GSK923295A e Compound A, que atuam através de mecanismos alostéricos distintos. Usando um rastreio de alto rendimento, foram calculadas as doses óptimas de inibição total e parcial de CENP-E e posteriormente verificada a sua ação na manutenção do alinhamento dos cromossomas através de microscopia em células vivas de alta resolução. Neste trabalho mostramos que a CENP-E é essencial para a manutenção do alinhamento dos cromossomas em células humanas com e sem CIN. A sensibilidade relativa dos inibidores é proporcional para o PF-2771 e para o GSK923295A quando comparamos linhas celulares com e sem CIN. Contudo, células diplóides são menos sensíveis à inibição da CENP-E quando usado o Compound A, sugerindo que este composto poderá ter um valor terapêutico superior no tratamento do cancro. Estes resultados permitem aprofundar o nosso conhecimento acerca do valor terapêutico dos inibidores da CENP-E que são atualmente testados em ensaios clínicos. === The goal of mitosis is to ensure faithful segregation of genomic content into two identical daughter cells. As cells enter mitosis, the DNA becomes condensed into mitotic chromosomes, which must establish stable attachments to the mitotic spindle. Upon establishing proper kinetochore-microtubule attachments, chromosomes can then be guided to the center of the cell. Notably, this process of chromosome congression is a prerequisite for faithful chromosome segregation, since errors in this process lead to aneuploidy and chromosomal instability (CIN). One of the key players involved in chromosome congression is CENP-E, a kinesin-like motor protein that is enriched at kinetochores during mitosis. Despite mounting evidence demonstrating a role for CENP-E in chromosome congression, the importance of CENP-E activity once chromosomes are already aligned, is currently unknown. To this purpose, we first determined the optimal dose for inhibiting CENP-E function in both CIN and non-CIN human cell lines using three independent CENP-E inhibitors: PF-2771, GSK923295A and Compound A, which act through distinct allosteric mechanisms. Using high-throughput screening, we calculated the optimal doses required for partial and total CENP-E inhibition and then performed high-resolution live cell imaging to directly test CENP-E function in the maintenance of chromosome alignment. We show that CENP-E is essential for the maintenance of chromosome alignment in both CIN and non-CIN human cells. We find that relative sensitivity to CENP-E inhibitors is proportional for PF-2771 and GSK923295A when comparing CIN and non-CIN cell lines. However, diploid cells are less sensitive to CENP-E inhibition using Compound A, suggesting that this compound may be of higher therapeutic value for the treatment of cancer. Taken together, these results offer insight for our understanding of the therapeutic value of CENP-E inhibitors currently tested in clinical trials.