Ανάπτυξη, βιοκατανομή και φαρμακοκινητική μελέτη πεπτιδικών αναλόγων μπομπεσίνης επισημασμένων με διαγνωστικά ραδιονουκλίδια για την αντιμετώπιση του καρκίνου

• Main Author: Λιόλιος, Χρήστος
• Other Authors: Σιβολαπένκο, Γρηγόρης
• Language: gr
• Published: 2013
• Subjects: Μπομπεσίνη; Πεπτίδια; Ραδιοφαρμακολογία; Φαρμακοκινητική; Διαγνωστικά ραδιονουκλίδια; Αντιμετώπιση καρκίνου; 616.994 061; Bombesin; Peptides; Radiopharmacology; Pharmacokinetics; Diagnistic radionuclides; Cancer treatment
• Online Access: http://hdl.handle.net/10889/5912

Η παρούσα διατριβή αναφέρεται στην ανάπτυξη νέων πεπτιδικών αναλόγων μπομπεσίνης (ΒΝ) με απώτερο στόχο την ενδεχόμενη κλινική εφαρμογή τους στο πεδίο της διαγνωστικής ογκολογίας με SPECT (Υπολογιστική Τομογραφία Εκπομπής ενός Φωτονίου, Single-photon emission computed tomography) και PET (Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίων, Positron emission tomography). Η ΒΝ αποτελεί έναν εξειδικευμένο πεπτίδιο-προσδέτη για τους υποδοχείς του πεπτιδίου απελευθέρωσης της γαστρίνης (gastrin-releasing peptide receptors, GRPrs), οι οποίοι υπερεκφράζονται στην επιφάνεια διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων. Οι υποδοχείς GRP δυνητικά θα μπορούσαν να θεωρηθούν ιδανικός στόχος για την απεικόνιση νευροενδοκρινικών όγκων μετά από χορήγηση ραδιοεπισημασμένων παραγώγων ΒΝ, με τεχνικές μοριακής διαγνωστικής, αλλά και για την στοχευμένη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου. Με αυτό τον στόχο σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα ΒΝ για τα οποία πραγματοποιήθηκε μία σειρά προκλινικών μελετών με σκοπό τη διαμόρφωση και την εφαρμογή ενός πλαισίου διάκρισης των κατάλληλων ραδιοχημικών και ραδιοφαρμακολογικών χαρακτηριστικών τα οποία θα μπορούσαν να οδηγήσουν ένα από αυτά τα υποψήφια διαγνωστικά σκευάσματα του σε κλινικές μελέτες ανίχνευσης του καρκίνου. Μέθοδος: Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα BN, κατάλληλα για επισήμανση με ραδιονουκλίδια, με την παρακάτω γενική δομή: Υ-Χ-ΒΝ(2-14) όπου Υ = ο χηλικός παράγοντας για τη σύμπλεξη του ραδιομετάλλου, Χ = η συνδετική ομάδα και ΒΝ(2-14) το φαρμακοφόρο τμήμα. (a) Προκειμένου να απεικονισθούν όγκοι με SPECT όπου: Υ = [GlyGlyCys-] για τη σύμπλεξη με το 99mTc και το 185/187Re (μη ραδιενεργό), Χ = -(αργινίνη)3-, (BN-A), ή -(ορνιθίνη)3-, (BN-O). (b) Ενώ για τη μοριακή απεικόνιση όγκων με την τεχνική PET, όπου Υ = [c-carboxylic acid-cyclam] για σύμπλεξη με 64Cu, και Χ = -(ορνιθίνη)3-, (BN-C). Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε το τμήμα της φυσικής αλληλουχίας του πεπτιδίου μπομπεσίνη, από το 2o εως το 14ο αμινοξύ, σε συνδυασμό με αμινοξική, θετικά φορτισμένη, συνδετική ομάδα (spacer). Τα παραπάνω παράγωγα και τα αντίστοιχα σύμπλοκα τους με τα μέταλλα αρχικά αξιολογήθηκαν χημικά και ραδιοχημικά με διάφορες αναλυτικές μεθόδους. Ακολούθησε η ραδιοφαρμακολογική αξιολόγηση τους με τις παρακάτω in vitro δοκιμασίες: (a) μελέτη σταθερότητας σε δείγματα αίματος, (b) προσδιορισμός της συγγένειας τους με τον GRPr (υπολογισμός τιμών IC50) και (c) του ρυθμού εσωτερικοποίησης/εξωτερικοποίησης σε κύτταρα PC-3 (ανθρώπινου καρκίνου προστάτη). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν μελέτες in vivo (βιοκατανομή, απεικόνιση με γ-κάμερα), σε φυσιολογικά ζωικά πειραματικά πρότυπα (ποντίκια, αρουραίους και κουνέλια) και σε πειραματικά πρότυπα καρκίνου (ποντίκια SCID, με όγκους από κύτταρα PC-3). Επιπλέον με βάση τα in vivo αποτελέσματα διεξάχθηκε η φαρμακοκινητική αξιολόγηση τους και ο συσχετισμός μεταξύ δομικών και φαρμακοκινητικών χαρακτηριστικών. Τέλος επιχειρήθηκε η αλλομετρική κλιμάκωση των φαρμακοκινητικών αποτελεσμάτων από τα διάφορα είδη πειραματοζώων στον άνθρωπο. Αποτελέσματα: Για τα παράγωγα τα οποία συντέθηκαν για σύμπλεξη με 99mTc προκειμένου να απεικονισθούν όγκοι με SPECT, παρατηρήθηκαν τα εξής: Τα BN-A και BN-O συμπλέχθηκαν αποτελεσματικά με το 99mTc (απόδοση > 98%), αλλά και το χημικά όμοιο του ρήνιο (μη ραδιενεργό). Κατά τις μελέτες σταθερότητας το παράγωγο 99mTc-BN-O αποδείχθηκε σταθερότερο του 99mTc-BN-Α, (π.χ. πλάσμα του ποντικού σε 5 min επώασης το % άθικτο πεπτίδιο ήταν 44.28 και 42.48, ενώ στο ανθρώπινο πλάσμα σε 1 ώρα επώασης ήταν 63.05 και 60.2 αντίστοιχα). Η συγγένεια πρόσδεσης στον GRPr των παραπάνω παραγώγων, αλλά και των συμπλόκων τους με το μη ραδιενεργό Re, τα οποία προσομοιάζουν τα αντίστοιχα ραδιενεργά σύμπλοκα τους με το 99mTc (IC50, BN-Α, 0.5 ± 0.09, 185/187Re-BN-A, 1.58 ± 0.16, BN-Ο, 0.46 ± 0.04, 185/187Re-BN-Ο, 0.77 ± 0.07 nM), ήταν κοντά στο πρότυπο [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM). Το συνολικό ποσοστό εσωτερικοποίησης των παραπάνω συμπλόκων 99mTc-BN-Α και 99mTc-BN-Ο στα κύτταρα PC-3 ήταν παρόμοιο (~25%), αλλά ο ρυθμός εσωτερικοποίησης τους διέφερε, καθώς χρειάστηκαν 120 min και 60 min για φτάσουν τη μέγιστη τιμή εσωτερικοποίησης αντίστοιχα. Ο ρυθμός εξωτερίκευσης ήταν ο ίδιος. Μετά από 90 min επώασης το ~ 70% της αρχικής ποσότητας πεπτιδίου παραμένει εγκλωβισμένο στα κύτταρα. Από τις μελέτες βιοκατανομής και φαρμακοκινητικής του 99mTc-BN–A και του 99mTc-BN–Ο σε φυσιολογικά ποντίκια φάνηκε ότι και τα δύο ραδιοπεπτίδια απομακρύνονται γρήγορα από το αίμα, καθώς μικρό ποσοστό της χορηγούμενης δόσης (ID)/g (2.61 και 2.76 % αντίστοιχα) παραμένει 30 min μετά τη χορήγηση (p.i.). Η βασική οδός απομάκρυνσης τους από τον οργανισμό ήταν το ουροποιητικό σύστημα καθώς μεγάλο ποσοστό των ραδιοπεπτιδίων εντοπίστηκε στα ούρα 1 h p.i. (64.16 και 56.33 % ID αντίστοιχα). Το γεγονός αυτό συσχετίσθηκε με την παρουσία της θετικά φορτισμένης συνδετικής ομάδας. Η νεφρική απέκκριση επιδιώκεται έναντι της ηπατοχολικής, γιατί με αυτόν τον τρόπο μειώνεται η συσσώρευση της ραδιενέργειας στην άνω κοιλιακή χώρα και διευκολύνεται η εντόπιση όγκων στην περιοχή αυτή. Το 99mTc-BN–A απομακρύνεται ταχύτερα από το αίμα από τα νεφρά και γενικότερα από τον οργανισμό από ότι το 99mTc-BN–Ο, αλλά εμφανίζει μεγαλύτερη συσσώρευση στο ήπαρ (4.43 ± 1.04 και 0.99 ± 0.20 %ID/g, 60 min p.i. αντίστοιχα). Από τις μελέτες βιοκατανομής και απεικόνισης με γ-κάμερα σε ποντίκια SCID με όγκους PC-3 το παράγωγο 99mTc-BN–A εντόπισε αποτελεσματικά τον όγκο. Μετά από πειράματα συγχορήγησης φυσικής ΒΝ παρατηρήθηκε μείωση του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου στον όγκο και στο πάγκρεας, τα σημεία στα οποία εντοπίζονται υποδοχείς GRPrs, επιβεβαιώνοντας έτσι την ειδική δέσμευση του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου σε αυτούς. Συγκρίνοντας τα παραπάνω αποτελέσματα με το 99mTc-BN–Ο διαπιστώθηκαν καλύτεροι λόγοι διάκρισης από το 99mTc-BN–A στους διάφορους χρόνους μελέτης (π.χ. 60 min p.i. ήταν όγκος/αίμα, 6.67 έναντι 3.62, όγκος/μύες, 14.0 έναντι 5.60, όγκος/ήπαρ, 2.9 έναντι 0.82, αντίστοιχα). Εξαιτίας όλων των παραπάνω αποτελεσμάτων το παράγωγο 99mTc-BN-Ο επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Για το 99mTc-BN-Ο πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω in vitro μελέτες σταθερότητας σε πλάσμα αίματος αρουραίων και κουνελιών και in vivo μελέτες βιοκατανομής (απεικόνισης σε γ-καμερα). Παράλληλα πραγματοποιήθηκε και η φαρμακοκινητική ανάλυση των δεδομένων. Επιπλέον επιχειρήθηκε να αντιμετωπισθεί το πρόβλημα της νεφρικής συσσώρευσης του 99mTc-BN-Ο στα νεφρά με τη συγχορήγηση Gelofusine (Gelo). Από τη συγχορήγηση Gelo στα φυσιολογικά (ποντίκια, αρουραίοι) και καρκινικά πειραματικά πρότυπα (ποντίκια SCID με όγκους PC-3) παρατηρήθηκαν ταχύτερη κάθαρση του αίματος και αποβολής από τα νεφρά. Τέλος πραγματοποιήθηκε πρωτότυπη μελέτη αλλομετρικής κλιμάκωση των φαρμακοκινητικών αποτελεσμάτων του 99mTc-BN-Ο με στόχο την πρόβλεψη της συμπεριφοράς του καθώς της συμπεριφοράς παρόμοιων μορίων στον άνθρωπο κατά τη διεξαγωγή κλινικών μελετών. Εξαιτίας των παραπάνω θετικών αποτελεσμάτων αναφορικά με το τμήμα Η2Ν-(ορνιθίνη)3-ΒΝ(2-14) και προκειμένου να επιτευχθεί η βελτιστοποίηση της ικανότητα σύμπλεξής του με ιόντα χαλκού (π.χ. 64Cu για διάγνωση με PET) συνδέθηκε ομοιοπολικά με αυτό ένας νέος χηλικός παράγοντα το c-carboxylic acid cyclam. Από την ομοιοπολική σύζευξη των παραπάνω προέκυψε ένας νέο ανάλογο ΒΝ, το ΒΝ-C. Με τη χρήση διαφόρων αναλυτικών τεχνικών (IR, UV-Vis, ESI-MS, ESR, κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ) διαπιστώθηκε ότι τόσο ο c-carboxylic acid cyclam όσο και ΒΝ-C, ο τελικός πεπτιδικός προσδέτης, έχουν την ικανότητα σύμπλεξης με CuII. Το πεπτιδικό παράγωγο BN-C και το σύμπλοκο του με το χαλκό, Cu-BN-C. δοκιμάσθηκαν ως προς τη συγγένεια δέσμευσης τους με τον GRPr σε κυτταρικές καλλιέργειες PC-3 όπου και παρουσίαζαν συγγένεια (IC50 = 0.3 ± 0.03 και 0.33 ± 0.03 nM, αντίστοιχα) παρόμοια με το πρότυπο πεπτίδιο προσδέτη [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM). Συμπέρασμα: Οι παραπάνω μελέτες οριοθετούν ένα γενικότερο πλαίσιο προκλινικού προσδιορισμού εκείνων των ραδιοχημικών και ραδιοφαρμακολογικών in vitro και in vivo ιδιοτήτων, οι οποίες θα μπορούσαν να οδηγήσουν ένα παράγωγο ΒΝ σε περαιτέρω κλινικές μελέτες. Με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκε και αναπτύχθηκε ένα πεπτιδικό ανάλογο ΒΝ, το οποίο σε κάθε περίπτωση αποδείχθηκε ότι διαθέτει τον κατάλληλο συνδυασμό των παραπάνω χαρακτηριστικών για περαιτέρω ανάπτυξη ως ραδιοδιαγνωστικό σκεύασμα για SPECT (BN-O) και PET (ΒΝ-C) σε κλινικό επίπεδο. Επιπλέον η φαρμακοκινητική ανάλυση και η αλλομετρική κλιμάκωση των παραπάνω αποτελεσμάτων συνεισφέρουν σημαντικά στην αύξηση της πιθανότητας μελλοντικής κλινικής εφαρμογής των παραπάνω παραγώγων στον άνθρωπο. === The present Thesis refers to the development of new peptidic bombesin (BN) analogs for application in the field of tumor diagnosis with the SPECT (Single-photon emission computed tomography) and PET (Positron emission tomography) techniques. The BN peptide is a specific ligand for the gastrin-releasing peptide receptors (GRPrs), which are over-expressed on the surface of various types of tumor cells. GRPrs can be considered as an ideal target for radiolabeled BN analogues in the molecular diagnosis of neuro-endocrine tumors as well as in the targeted treatment of cancer. Taking the above into consideration, three BN analogues were designed and synthesized as potential molecular diagnostics of tumors. Thus, a series of preclinical studies were conducted in order to find out the best candidate for further development in clinical studies. Methods: All the BN analogues of the present study can be described by the following general structure: Υ-Χ-ΒΝ(2-14) Where Y = the chelator group for the radionuclide, X = a spacer group and BN(2-14) = the pharmacophore group. (a) For the diagnosis of tumors with SPECT: Υ = [GlyGlyCys-], suitable for the complexation of 99mTc and 185/187Re and X= -(arginine)3-, (BN-A), or -(ornithine)3-, (BN-O). (b) Further on, for tumor diagnosis with PET: Υ = [c-carboxylic acid-cyclam] suitable for the complexation of 64Cu, και Χ = -(ornithine)3-, (BN-C). For all the above cases the part from the 2nd to the 14th amino acid of the naturally occurring BN was used, in combination with a spacer group composed of three positively charged amino acids. The amino acids were either naturally occurring (arginine) or not (ornithine). The above BN analogues as well as their metal complexes were chemically and radiochemically analyzed and evaluated in vitro. The in vitro evaluation of the BN derivatives included assays for the determination of (a) their stability in blood samples, (b) their affinity for the GRPrs (by the calculation of their IC50 values), (c) as well as of their internalization and externalization rates in PC-3 cell (human prostate cancer cell line) cultures. Additionally a series of in vivo assays were conducted including: biodistibution studies in normal (mice, rats, rabbits) and in experimental cancer animal models (SCID mice with PC3 tumors). For the later in addition to the biodistribution tumor imaging studies were carried out using an experimental small animal gamma camera. Based on the results of the in vivo studies, a series of pharmacokinetic analyses were performed and the results were correlated with the structural characteristics of the BN analogues. Finally, the results from the pharmacokinetic analyses of the three different animal species, (mouse, rat, rabbit) were combined and scaled up for a human of 70 Kg, by using the allometric approach. Results: The BN analogues BN-A and BN-O, which were designed for application in tumor imaging with SPECT, were able to form stable complexes with 99mTc (in high yield > 98%), as well as with Re (non radioactive). The two elements 99mTc and Re belong to the same group of the Periodic Table of elements and thus they are considered to have similar chemical properties. During the in vitro stability assays 99mTc-BN-O prove to be more stable than the 99mTc-BN-Α i.e. the % percentages of intact peptide for mouse plasma (after 5 min incubation) were 44.28 and 42.48 %, while for human plasma the percentages of intact peptide (after 1h of incubation) were 63.05 and 60.2 respectively. The affinities (IC50 values) of BN-Α (0.5 ± 0.09 nM), and BN-Ο (0.46 ± 0.04 nM), as well as of their non radioactive complexes with Rhenium 185/187Re-BN-A, 1(.58 ± 0.16 nM) and 185/187Re-BN-Ο (0.77 ± 0.07 nM) were similar to the one of the control peptide [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM). Although the total amount of internalized radiolabeled peptide was the same for both 99mTc-BN-Α and 99mTc-BN-O (~25%), their rates of internalization differed. The ornithine-spacer analogue, 99mTc-BN-O, internalized a lot faster (60 min for maximum internalization plateau) than the arginine-spacer analogue, 99mTc-BN-Α (120 min for maximum internalization plateau). The externalization rates for both analogues were the same, with ~ 70% of the initially internalized radiolabeled peptide remaining inside the cells even after 90 min of incubation. From the biodistribution and pharmacokinetic studies of 99mTc-BN–A and 99mTc-BN–Ο a fast blood clearance was observed for both peptides, with small amounts of the initial dose remaining in the blood stream 30 min p.i. (2.61 and 2.76 % ID/g, respectively). The main clearance route throughout the body in both cases was the urinary system and high percentages of the radiolabeled peptides were detected in the urine 1 h p.i (64.16 and 56.33 % ID respectively). The latter was related to the presence of the positively charged spacer group. A clearance through the urinary system is preferred instead of the hepatobiliary system since in that way the decrease of the upper abdominal region background radiation is achieved. Although the arginine-spacer analogue 99mTc-BN–A was cleared from the kidneys and the body with higher rates than 99mTc-BN–Ο, it showed a higher liver accumulation than the latter (4.43 ± 1.04 and 0.99 ± 0.20 %ID/g, 60 min p.i. respectively). Both in the biodistribution and in the gamma-camera tumor-imaging studies the BN analogue 99mTc-BN–A was able to efficiently locate the tumour. During the GRPrs blocking studies the amount of 99mTc-BN–A was reduced both in the tumour and in the pancreas, where the GRPrs are located, proving thus the specific binding of 99mTc-BN–A to those receptors. Comparing the tumor/normal tissue contrast ratios between 99mTc-BN–Ο and 99mTc-BN–A the ornithine spacer analogue proved a better choice since it presented greater values (i.e. 60 min p.i. tumor/blood, 6.67 vs 3.62, tumor/muscle, 14.0 vs 5.60, tumor/liver, 2.9 vs 0.82, respectively). According to all the above results 99mTc-BN-Ο was selected between the two SPECT tumor imaging agent candidates for further studies. For 99mTc-BN-Ο additional in vitro stability assays were conducted in rats and rabbits plasma, which were followed by in vivo biodistribution studies in normal rats and imaging studies in normal rabbits. The in vivo data were analyzed with the appropriate pharmacokinetic approaches. In an effort to achieve a faster clearance of 99mTc-BN-Ο from the kidneys a new approach was tested by its co-injection with Gelofusine (Gelo). During the Gelo co-injection studies in normal mice, in rats as well as in SCID mice with PC-3 tumors a faster renal clearance was observed. Finally by combining the in vivo results of 99mTc-BN-Ο from the three different animal species (mice, rats, rabbits) the allometric scale up of the pharmacokinetic parameters was achieved and the prediction of those parameters for a man of 70 kg. The results of latter study could probably be extended to predict the pharmacokinetic profile of other similar molecules in the preclinical stage of development. Due to promising results of obtained from the BN analogue with the ornithine spacer, Η2Ν-(ornithine)3-ΒΝ(2-14), and in order to improve its ability to form complexes with copper radionuclides i.e. 64Cu, which are suitable for PET imaging, a new chelator group was introduced into the peptide sequence. The chelator group c-carboxylic acid cyclam was covalently attached to the peptide chain Η2Ν-(ornithine)3-ΒΝ(2-14) to give a new bombesin analogue ΒΝ-C. The chelator group and the new BN analogue were able to form complexes with cold copper fast and under mild conditions. The copper complexes of the above molecules were analyzed with a variety of techniques like IR, UV-Vis, ESI-MS, ESR, X ray crystallography. Additionally both the BN analogue BN-C and its complex with copper Cu-BN-C were tested for their affinity for GRPrs in PC-3 cell lines, where it was found that their IC50 values of both were similar (IC50 = 0.3 ± 0.03 και 0.33 ± 0.03 nM, respectively) to the control peptide [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM). Conclusion: The above studies can be considered the essential parts of a discrimination process of the ideal radiochemical and radiopharmacological characteristics, which could lead a BN analogue to clinical trials. According to the results of the above preclinical studies a suitable BN analogue was selected for further clinical development as a tumor imaging agent with SPECT (BN-O) as well as PET (ΒΝ-C). Additionally the pharmacokinetic analysis in three different animal species and allometric scale up of those parameters for the human will enhance the probability of its further application in clinical trials.